靶向核殼蛋白基因的siRNA對(duì)流感病毒的預(yù)防和治療作用

史 亮 尹申慧 任 浩 高 榮 馬 壯 孫文武 曹建平

流感病毒感染是一種主要的公共健康問(wèn)題，每年在世界方位內(nèi)引起了數(shù)百萬(wàn)的嚴(yán)重病例，290 000～650 000人死亡[1-3]。由于流感病毒的傳播方式簡(jiǎn)單到吸入含有病毒顆粒的飛沫或接觸被污染的物品即可傳染，其傳播速度非常迅速。在人口稠密區(qū)或公共聚集區(qū)傳播速度更快，更有效，因此非常難以控制。目前，抗病毒藥物是抵抗甲型流感病毒(influenza virus A, IAV)感染的防御手段，但是已經(jīng)出現(xiàn)藥物抵抗株[4-7]。疫苗仍然是預(yù)防IAV感染的最有效方法。然而，IAV的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)移對(duì)于可用疫苗是一個(gè)永遠(yuǎn)變化的挑戰(zhàn)[8-9]，而且生產(chǎn)疫苗的時(shí)間落后于在大流行時(shí)的大規(guī)模預(yù)防[10-12]?？紤]到目前抗流感病毒策略的局限性，很明顯需要新的預(yù)防和治療IAV的策略[13-14]。RNA干擾(RNAi)是一個(gè)雙鏈RNA針對(duì)序列特異性降解同源mRNA的過(guò)程[15-17]。RNAi技術(shù)對(duì)于解決上述問(wèn)題具有廣闊前景。Ge等[18]證實(shí)對(duì)流感病毒基因組保守區(qū)的siRNA在細(xì)胞株中可強(qiáng)烈地抑制流感病毒產(chǎn)生。它們也證實(shí)siRNAs在小鼠中可以預(yù)防和治療流感病毒感染[19]。研究結(jié)果顯示對(duì)H5N1禽流感病毒M2和NP特異的siRNA可以抑制不同亞型的甲型流感病毒(H5N1, H7N9, H1N1)的復(fù)制[20]。IAV在其基因組中由8個(gè)RNA片段組成。其中血凝素(hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase, NA)是兩個(gè)其抗原經(jīng)常變化的片段。因此，不適合作為RNAi的靶標(biāo)。其它六個(gè)片段對(duì)于病毒復(fù)制是必需的，在IAV各個(gè)亞型之間都是保守的。本文對(duì)IAV測(cè)序的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了對(duì)NP保守區(qū)特異的siRNA，并觀察了在MDCK細(xì)胞中先轉(zhuǎn)染了siRNA然后以IAV感染，或先以IAV感染，然后轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)MDCK細(xì)胞產(chǎn)生IAV的影響。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 病毒，細(xì)胞系及siRNA： 甲型流感病毒，A/Shanghai/N33/(2008) H1N1,由海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系提供。所有用H1N1的實(shí)驗(yàn)均在海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。MDCK細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含有10% FCS，2 mm L-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM，37 ℃，5% CO2。IAV的NP特異性siRNA序列為5′-GCUGGUCUGACUCACAUAAUG-3′和5′-CAUUAUGUGAGUCAGACCAGC-3′，由Obio技術(shù)(上海)有限公司根據(jù)NP片段的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)，由TaKaRa生物技術(shù)公司合成。

2. siRNA轉(zhuǎn)染： 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞以5×104/孔的密度接種到24孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，使用Lipofectamine RNAiMAX試劑盒(invitrogen)，按照廠家的說(shuō)明書以靶向NP的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以劑量為20 pmol，40 pmol和80 pmol的siRNA分別轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照中，加入相同體積的沒(méi)有siRNA轉(zhuǎn)染試劑。在IAV對(duì)照中，加入相同體積的opti-MEMTM培養(yǎng)基。不同劑量的siRNA組及對(duì)照組做6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板在37 ℃，5% CO2孵育24 h。然后以5×107TCID50的H1N1病毒感染細(xì)胞，孵育2 h。以PBS洗細(xì)胞3次后，細(xì)胞在流感病毒維持液中培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以RT-PCR測(cè)定病毒載量。將不同劑量的siRNA加入24孔板，每個(gè)劑量做6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

3. 病毒感染： 轉(zhuǎn)染后48 h，除去培養(yǎng)基，用PBS洗3次。然后，向孔中加入1 ml流感病毒維持液(DMEM 含有2 mm L-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，0.2% BSA，25 mm HEPES)含有2 μg/ml TPCK-trypsin和5×107TCID50的H1N1流感病毒。2 h后去除培養(yǎng)基，以PBS洗細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)于流感病毒維持液中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。48 h后收獲上清，以RT-PCR測(cè)定病毒載量。

為了測(cè)試細(xì)胞被IAV感染后siRNA是否能夠抑制IAV的產(chǎn)生，首先以IAV感染MDCK細(xì)胞。2 h后，吸棄培養(yǎng)液，以PBS洗細(xì)胞3次，細(xì)胞培養(yǎng)于流感病毒維持液中。使用Lipofectamine RNAiMAX試劑盒(invitrogen)，按照廠家的說(shuō)明書以靶向NP的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(80 pmol/孔)。細(xì)胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。48 h后收獲上清，以RT-PCR測(cè)定病毒載量。

4. 總RNA提取和qRT-PCR： 收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，以TRIzol (Life Technologies)試劑按廠商的說(shuō)明書提取總RNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR)，所用反應(yīng)成分均購(gòu)于同一廠家(TaKaRa Biotechnology)。根據(jù)廠商的說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)色實(shí)驗(yàn)。使用Prime ScriptTMRT Master試劑盒(Takara, Biotechnology Co., Ltd)在42 ℃，15 min然后95 ℃，5 min將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物設(shè)計(jì)如下：H1N1引物F：5′TTCTAACCGAGGTCGAAACG3′和R：5′ACAAAGCGTCTACGCTGCAG3′。退火溫度60 ℃。所有反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔。

5. 免疫熒光： 將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于孔底部帶有無(wú)菌蓋玻片的24孔板中。轉(zhuǎn)染siRNA和感染IAV的操作如上所述。轉(zhuǎn)染或感染后48 h，將蓋玻片上的細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，室溫30 min，然后以PBS洗3次。以0.1%曲拉通-X 100室溫處理細(xì)胞30 min，然后以FBS封閉。以小鼠單克隆抗甲型流感病毒NP抗體(influenza A NP (5D8)：sc-80481, Santa cruz Biotechnology, Inc)染色，4 ℃過(guò)夜。以PBS洗3次后，加入FITC交聯(lián)的結(jié)合蛋白(m-IgGκ BP-FITE: sc-516140, Santa cruz Biotechnology, Inc)，室溫孵育90 min。以Hoechst 33342染色細(xì)胞核。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。以Image J software軟件分析NP蛋白的熒光強(qiáng)度。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、NP特異的siRNA以劑量依賴方式抑制IAV產(chǎn)生

以不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，然后以H1N1感染細(xì)胞。48 h后以實(shí)時(shí)定量TR-PCR測(cè)定病毒載量。結(jié)果顯示在20 pmol，40 pmol和80 pmol siRNA組，以及轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照和IAV對(duì)照組中，IAV mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.123±0.101，0.113±0.075，0.060±0.039，0.453±0.263和0.579±0.252。和IAV對(duì)照相比，在20 pmol，40 pmol和80 pmol siRNA組中IAV的產(chǎn)生均顯著降低(P<0.01)。和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組相比，在20 pmol和40 pmol siRNA組中，IAV的產(chǎn)生減少(P<0.05)，80 pmol siRNA組中，IAV的產(chǎn)生顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖1。這些結(jié)果表明靶向甲型流感病毒NP片段的siRNA以劑量依賴方式顯著抑制IAV的產(chǎn)生。

圖1 NP特異的siRNA對(duì)MDCK細(xì)胞中IAV的產(chǎn)生的影響；注：**：P<0.01, 和IAV對(duì)照相比；#:P<0.05，和轉(zhuǎn)染液對(duì)照相比；##：P<0.01，和轉(zhuǎn)染液對(duì)照相比

二、預(yù)先以IAV感染MDCK細(xì)胞，siRNA也能降低IAV的產(chǎn)生

在本實(shí)驗(yàn)中，先以IAV感染MDCK細(xì)胞。2 h后，以siRNA轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h，提取總RNA，測(cè)定病毒載量。結(jié)果顯示siRNA組，轉(zhuǎn)染劑對(duì)照組和IAV對(duì)照組的IAV mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.105±0.08，0.799±0.509和0.906±0.321。siRNA組的IAV產(chǎn)生顯著小于IAV對(duì)照組(P<0.01)和轉(zhuǎn)染劑對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 NP特異的siRNA對(duì)已感染IAV的MDCK細(xì)胞中IAV的產(chǎn)生的影響；注：**：P<0.01，和IAV對(duì)照相比；*：P<0.05，和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照相比

三、NP特異的siRNA在MDCK細(xì)胞中對(duì)IAV的抑制是由于干擾了NP蛋白合成

不論MDCK細(xì)胞是先轉(zhuǎn)染siRNA還是先感染IAV，轉(zhuǎn)染了靶向NP的siRNA的MDCK細(xì)胞中，NP蛋白的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，圖3～4。

圖3 預(yù)先轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)MDCK感染IAV后NP蛋白合成的影響；注：A：轉(zhuǎn)染了NP特異性siRNA 的MDCK細(xì)胞的免疫熒光圖像；(A)對(duì)照組細(xì)胞的熒光圖像;(B)轉(zhuǎn)染了siRNA細(xì)胞的熒光圖像; (C)對(duì)照組中以Hoechst 33342染色的細(xì)胞核; (D)轉(zhuǎn)染了siRNA 的細(xì)胞中以Hoechst 33342染色的細(xì)胞核；B：對(duì)照組和轉(zhuǎn)染了siRNA細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；以Image J 軟件分析兩組細(xì)胞NP蛋白的熒光強(qiáng)度。**,P<0.01和對(duì)照組相比，(n=30)

討 論

小干擾RNA是進(jìn)化過(guò)程中的一種保守的防御機(jī)制，憑借這種機(jī)制防御外來(lái)病毒。與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA具有同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA可以在其導(dǎo)入細(xì)胞后降解該mRNA，因此導(dǎo)致相應(yīng)的功能和表型的缺失[21-22]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNA干擾在藥物應(yīng)用方面具有廣闊前景，特別是小干擾RNA在臨床應(yīng)用方面更有價(jià)值。siRNAs可以治療病毒感染[23-26]。通過(guò)這種技術(shù)可以抑制病毒的復(fù)制，沉默病毒基因的表達(dá)。更精確地設(shè)計(jì)沉默序列可以抑制病毒衣殼蛋白。根據(jù)最近的報(bào)道，有學(xué)者做了一個(gè)隨機(jī)的，雙盲的，安慰劑對(duì)照的試驗(yàn)，結(jié)果顯示在安慰劑和siRNA處理的受者中呼吸道合胞病毒感染的比例分別為71.4%和44.2%，代表感染數(shù)量降低38%，未感染數(shù)量增加95%。未觀察到明顯的不良事件發(fā)生[27]。這是第一次siRNA作為抗病毒制劑用于人類，結(jié)果是令人鼓舞的。

圖4 siRNA對(duì)預(yù)先感染IAV的MDCK細(xì)胞NP蛋白合成的影響；注：A：轉(zhuǎn)染了NP特異性siRNA 的MDCK細(xì)胞的免疫熒光圖像；(A)對(duì)照組細(xì)胞的熒光圖像;(B)轉(zhuǎn)染了siRNA細(xì)胞的熒光圖像;(C)對(duì)照組中以Hoechst 33342染色的細(xì)胞核;(D)轉(zhuǎn)染了siRNA 的細(xì)胞中以Hoechst 33342染色的細(xì)胞核；B：對(duì)照組和轉(zhuǎn)染了siRNA細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；以Image J軟件分析兩組細(xì)胞NP蛋白的熒光強(qiáng)度。**，P<0.01，和對(duì)照組相比，(n=30)

本文結(jié)果顯示：靶向IAV的NP的siRNA在MDCK細(xì)胞中可以以劑量依賴的方式抑制IAV的產(chǎn)生。siRNA對(duì)IAV的抑制作用是由于干擾了NP蛋白的合成。IAV的NP片段在該病毒復(fù)制中起了重要作用。Ge等[18]證實(shí)NP-或PA特異性的siRNA不僅干擾NP-或PA特異性mRNA積聚，也干擾其他病毒基因的積聚，如M, NS1, PB1, PB2和PA。他們認(rèn)為NP-特異性siRNA在被感染細(xì)胞中抑制所有病毒RNA的積聚是因?yàn)樵贜P特異性siRNA存在的情況下降解了轉(zhuǎn)錄的NP mRNA，導(dǎo)致了NP蛋白合成的抑制。沒(méi)有新合成的NP進(jìn)一步的病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制被阻斷，新的病毒粒子的產(chǎn)生也是如此。他們的發(fā)現(xiàn)表明在流感病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中絕對(duì)需要新和成的NP和PA蛋白。他們認(rèn)為基質(zhì)蛋白(M)并不是必需的直到病毒感染的后期。但是Sui等[28]證明在穩(wěn)定的細(xì)胞株中M2特異的shRNA顯示出比NP特異的shRNA更高的H1N1病毒的抑制作用，M2特異的shRNA也能抑制NP的mRNA積聚和蛋白表達(dá)。我們的結(jié)果和文獻(xiàn)一致[18]。

然后，本文證明了在預(yù)先感染了IAV的MDCK細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siRNA也可以一直IAV的產(chǎn)生。這表明siRNA不但可以預(yù)防，也可以治療IAV感染。該結(jié)果在臨床應(yīng)用方面具有重要意義，它意味著siRNA不僅可以保護(hù)上呼吸道上皮細(xì)胞免于IAV感染，而且在細(xì)胞已經(jīng)感染了IAV病毒后也可以降低IAV病毒的載量。

總之，研究表明對(duì)IAV病毒NP片段特異的siRNA可以抑制MDCK細(xì)胞中IAV病毒的產(chǎn)生，不論該細(xì)胞是在轉(zhuǎn)染siRNA之前還是在轉(zhuǎn)染siRNA之后感染IAV病毒。該siRNA抑制IAV產(chǎn)生是因?yàn)槠涓蓴_了IAV的NP蛋白的合成。本文為進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用RNA干擾技術(shù)預(yù)防和治療流感病毒感染提供了實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。