枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)及對水稻葉瘟防治效果

朱華珺 周瑚 任佐華 劉二明,

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，長沙 410128；2 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128；3 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128；*通信聯(lián)系人，E-mail：ermingliu@163.com)

稻瘟病是最具破壞性的水稻真菌性病害之一，每年能夠造成全球水稻減產(chǎn)10%～30%[1]。盡管化學農(nóng)藥能夠快速有效地防治植物病害，但過度使用會導致植物病原物的抗藥性上升和并影響食物安全[2-4]。由于來自微生物代謝產(chǎn)物研發(fā)的生物農(nóng)藥負面影響小、環(huán)境相容性和有害生物防治效果好，微生物代謝產(chǎn)物的研發(fā)成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要途徑[5-6]。

生防細菌目前主要包括芽孢桿菌、假單胞菌及鏈霉菌，其中芽孢桿菌是一類內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，其具有產(chǎn)生多種生物活性化合物的能力，因此是商業(yè)開發(fā)的首選[7]。芽孢桿菌的生防機制包括競爭作用、拮抗作用、誘導植物抗病性三方面[8-9]，拮抗作用是指生防菌在其生長代謝過程中產(chǎn)生的各種活性物質(zhì)抑制病原菌的生長，在植物病害的防治中發(fā)揮著重要作用。近年已報道了芽孢桿菌的各種抗菌物質(zhì)，如酶類、脂肽類、蛋白類物質(zhì)[10-12]，其活性范圍廣、毒性低、對環(huán)境友好，被認為是拮抗植物病原物的潛在藥劑。迄今為止，我國新登記的防治稻瘟病的芽孢桿菌制劑有19 種，其中枯草芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分別為15 種、3 種和1 種[13]。

本實驗室于2014 年從湖南桃江山區(qū)單季稻感稻瘟病品種湘早秈24 號的感病稻叢的健康稻株中分離出817 株菌株，采用平板對峙法，篩選出1 株對稻瘟病菌具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌JN005，并已獲得中國國家發(fā)明專利[14]。本研究初步分析枯草芽孢桿菌JN005 菌株的抑菌物質(zhì)，從中提取出對稻瘟病菌有拮抗效果的胞外抗菌物質(zhì)，并對其抗菌活性和穩(wěn)定性進行了測定，同時，進一步研究了胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌生長和致病性的影響，研究結(jié)果可為枯草芽孢桿菌JN005 菌株的開發(fā)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試拮抗菌枯草芽孢桿菌JN005 是本課題組從湖南桃江山區(qū)單季稻感病品種湘早秈24 號的感稻瘟病稻叢的健康稻株中分離獲得[15]，供試病原菌稻瘟病菌TJ40-2-1[16]，均由湖南農(nóng)業(yè)大學植物病原微生物及水稻病害實驗室保存。

1.1.2 供試水稻品種

感稻瘟病品種湘晚秈12 號來自湖南金色農(nóng)豐種業(yè)有限公司。

1.1.3 供試農(nóng)藥

40%稻瘟靈(EC)和75%三環(huán)唑(WP)分別來自江蘇龍燈化學有限公司和上海滬聯(lián)生物藥業(yè)（夏邑）股份有限公司。

1.2 JN005 菌株抑菌物質(zhì)的初步測定

1.2.1 產(chǎn)酶活性、產(chǎn)嗜鐵素特性檢測

將5 μL 的JN005 菌株發(fā)酵液分別接在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、纖維素酶選擇性培養(yǎng)基、0.2%可溶性淀粉培養(yǎng)基、β-1, 3-葡聚糖酶培養(yǎng)基、膠體幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基和CAS 培養(yǎng)基平板上，干燥后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h、48 h 和72 h 觀察菌落的生長情況和水解圈，每處理重復3 次。

1.2.2 揮發(fā)性氣體拮抗活性檢測

在NA 培養(yǎng)基平板上劃線接種JN005 菌株，同時在PDA 培養(yǎng)基平板上接種6 mm 稻瘟病菌菌餅，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，移去兩個培養(yǎng)皿的皿蓋，將皿底相對而扣，上皿為接種稻瘟病菌菌餅平板，下皿為接種JN005 菌株平板，并用封口膜將培養(yǎng)皿外側(cè)固定封口，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d 后進行觀察，每處理重復3 次，設(shè)不接JN005 菌株的空白對照。

1.2.3 胞外抗菌物質(zhì)拮抗活性檢測

將JN005 菌株接在NB 培養(yǎng)液中，置于30℃、200 r/min 搖床中發(fā)酵培養(yǎng)5 d 后，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，用0.22 μm 細菌過濾器過濾得代謝產(chǎn)物液。采用硫酸銨分級沉淀法提取胞外抗菌物質(zhì)：在常溫條件下，將固體硫酸銨研磨成粉末狀，邊緩慢加入代謝產(chǎn)物液中邊輕輕攪動液體直至充分溶解，使其飽和度達到80%，置于4℃下靜置24 h 后析出深褐色沉淀，4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取沉淀溶解于PBS 緩沖液中，再將溶解好的液體裝于透析袋(8 000～14 000 D)中并置于相同PBS 緩沖液中24 h 透析除鹽，透析液用0.22 μm 細菌過濾器過濾后，將液體體積調(diào)整為代謝產(chǎn)物液體積的1/20，獲得胞外抗菌物質(zhì)粗提液，用考馬斯亮藍法測定樣品濃度并檢測其抑制稻瘟病菌活性。按平板對峙法將6 mm 稻瘟病菌菌餅接在PDA 培養(yǎng)基平板中央位置，在距離菌餅中心左右25 mm 處用6 mm 打孔器各打一孔，向內(nèi)各注入60 μL 的胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后測量菌落直徑，計算抑菌直徑[抑菌直徑(mm)=對照組菌落直徑(mm)-處理組菌落直徑(mm)]，每處理重復3 次，設(shè)PBS 緩沖液的空白對照。

1.3 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

1.3.1 溫度對活性的影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液分別置于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下恒溫處理30 min 后，冷卻至室溫，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。

1.3.2 pH 對活性的影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液分別用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L 氫氧化鈉溶液將其pH 調(diào)至2～12，置于4℃下靜置24 h 后pH 調(diào)回中性，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。

1.3.3 蛋白酶對活性的影響

在胞外抗菌物質(zhì)粗提液中分別加入等體積的1 mg/mL 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶K、鏈蛋白酶，充分混勻后常溫下靜置1 h，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。

1.3.4 紫外照射對活性的影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液置于距離28 W 紫外燈光的10 cm 處，分別照射15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h 和12 h，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。

1.3.5 儲存時間對活性影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液置于4℃下保存，每隔10 d 進行檢測，持續(xù)檢測120 d，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性。

1.4 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

1.4.1 對稻瘟病菌菌絲生長影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水分別稀釋20 倍、50 倍和100 倍，采用平板對峙法檢測對稻瘟病菌的抑制活性，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3 天將蓋玻片插入稻瘟病菌菌餅和加樣孔之間的培養(yǎng)基中，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)，待菌絲長至蓋玻片上時取出，制成玻片置于光學顯微鏡下觀察，設(shè)胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液、PBS緩沖液和無菌水的處理作對照。

1.4.2 對稻瘟病菌孢子萌發(fā)影響

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水分別稀釋20 倍、50 倍和100 倍，吸取3 個濃度的液體各500 μL 與稻瘟病菌分生孢子懸浮液(1×105個/mL)等量混合均勻，再吸取各混合液分別滴100 μL 于載玻片上，將載玻片架放于帶有淺層無菌水的培養(yǎng)皿中于28℃恒溫培養(yǎng)箱中加蓋保濕培養(yǎng)，每處理3 個重復，設(shè)胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液、PBS 緩沖液和無菌水的處理作對照，當無菌水處理的對照孢子萌發(fā)率達到90%以上時，觀察各處理孢子萌發(fā)情況。

1.5 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治

1.5.1 離體接種

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水稀釋100 倍，40%稻瘟靈(EC)用無菌水稀釋500 倍，75%三環(huán)唑(WP)用無菌水稀釋1500 倍。湘晚秈12 號盆栽種植，于5 葉1 心時，取添加適量吐溫的稻瘟病菌分生孢子液(1×105個/mL)，參照《水稻稻瘟病抗性室內(nèi)離體葉片鑒定技術(shù)規(guī)程》[17]進行離體葉片接種，即用昆蟲針對離體葉片正面制造3個微創(chuàng)傷點，在微創(chuàng)傷點上接種稻瘟病菌孢子懸浮液。接種后的培養(yǎng)皿置于28℃、相對濕度100%環(huán)境下，黑暗處理24 h 后，再按光照和黑暗正常周期交替培養(yǎng)，直至水稻葉片發(fā)稻瘟病。具體分為A、B 兩個處理，根據(jù)清水對照處理的發(fā)病情況，計算發(fā)病率。

試驗組A：離體葉片分別用胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS 緩沖液和清水浸濕5 min 并晾干，24 h 后接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液。試驗組B：離體葉片接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h 后分別用胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS 緩沖液和清水浸濕5 min 并晾干。

若病斑僅局限于葉片劃傷處，呈褐色點狀，病斑中無分生孢子形成，記為未發(fā)??；若病斑呈梭形，中央灰色的崩潰部生有菌絲和分生孢子，崩潰部的外圍可能有褐色壞死，最外層是淡黃色的中毒部，形狀不規(guī)則，邊緣呈現(xiàn)出暗綠色記為發(fā)病。

發(fā)病率(%)=(發(fā)病病斑數(shù)/調(diào)查總病斑數(shù))×100。

1.5.2 活體接種

將胞外抗菌物質(zhì)粗提液(濃度為1.54 mg/mL)用無菌水稀釋100 倍，40%稻瘟靈(EC)用無菌水稀釋500 倍，75%三環(huán)唑(WP)用無菌水稀釋1500 倍。把長至3 葉1 心的湘晚秈12 號秧苗盆栽移至溫室內(nèi)，取添加適量吐溫的稻瘟病菌分生孢子液(1×105個/mL)均勻噴霧在葉片上，置于28℃、相對濕度100%環(huán)境下，黑暗處理24 h 后，再按光照和黑暗正常周期交替培養(yǎng)，直至葉片發(fā)稻瘟病。具體分為C、D兩個處理，根據(jù)清水對照處理的發(fā)病情況，調(diào)查發(fā)病率和病級，計算病情指數(shù)和防治效果。

試驗組C：先分別噴施胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS 緩沖液和清水，24 h 后噴施稻瘟病菌分生孢子懸浮液。試驗組D：先噴施稻瘟病菌分生孢子懸浮液，24 h 后分別噴施胞外抗菌物質(zhì)稀釋液、40%稻瘟靈(EC)稀釋液、75%三環(huán)唑(WP)稀釋液、PBS 緩沖液和清水。

依據(jù)國際稻瘟病圃IRBN，葉瘟分級標準如下：0 級為無?。? 級為針頭狀大小褐點，無產(chǎn)孢中心；2 級為稍大的褐點(直徑1～2 mm)，多數(shù)褐點位于植株下部葉片；3 級為圓形稍長的灰色小病斑，多數(shù)病斑位于植株上部葉片；4 級為典型紡錘形病斑，直徑3 mm 以上，病斑面積4%；5 級為典型病斑，病斑面積4%～10%；6 級為典型病斑，病斑面積11%～25%；7 級為典型病斑，病斑面積16%～50%；8 級為典型病斑，病斑面積51%～75%；9 級病斑面積75%以上。

發(fā)病率(%)=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100；

病情指數(shù) = [∑ (各病級植株數(shù)×各級代表數(shù)值)/調(diào)查總植株數(shù)×最高級別值] ×100；

防治效果(%) =(對照病指?處理病指/對照病指)×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007 軟件進行圖表制作，采用IBM SPSS Statistics 19 軟件進行差異顯著性分析，不同字母表示在0.05 水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 JN005 菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)酶和產(chǎn)氣測定

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，JN005 菌株在膠體幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基和CAS 培養(yǎng)基平板上沒有形成水解圈，但在脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基、纖維素酶選擇性培養(yǎng)基、0.2%可溶性淀粉培養(yǎng)基和β-1, 3-葡聚糖酶培養(yǎng)基平板上形成水解圈，因而推測JN005 菌株不能分泌幾丁質(zhì)酶和嗜鐵素，但能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和β-1, 3-葡聚糖酶(圖1)。JN005 菌株的揮發(fā)性氣體對稻瘟病菌生長基本無影響，但JN005 菌株的胞外抗菌物質(zhì)粗提液能夠有效拮抗稻瘟病菌生長(圖2)。

2.2 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性

實驗結(jié)果表明，在0℃～100℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對稻瘟病菌的抑菌直徑會減小，但0℃和100℃處理對比，抑菌直徑只下降了2.11 mm(圖3-A)；JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液在pH 2～12 范圍內(nèi)拮抗稻瘟病菌活性較為穩(wěn)定，抑菌直徑未有大幅度變化，但pH=12處理最影響其活性；當胞外抗菌物質(zhì)粗提液與蛋白酶K 混合孵育后，抑菌直徑保持穩(wěn)定，未有活性損失，而木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和鏈蛋白酶則不同程度地降低了抑菌直徑(圖3-C)；胞外抗菌物質(zhì)粗提液在紫外下照射時間越長抑菌直徑隨之下降，但照射12 h 后依舊保持活性(圖3-D)；胞外抗菌物質(zhì)粗提液在4℃下保存3 個月以上仍然對稻瘟病菌生長具有拮抗作用，但隨著時間的推移抑菌直徑逐漸減小(圖3-E)。

2.3 光學顯微鏡下觀察JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)影響稻瘟病菌菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)

在光學顯微鏡下觀察稻瘟病菌菌絲，發(fā)現(xiàn)無菌水(圖4-A)和PBS 緩沖液(圖4-B)的對照組稻瘟病菌菌絲生長正常，菌絲呈條狀且筆直。加入胞外抗菌物質(zhì)粗提液的處理組稻瘟病菌菌絲生長異常：稀釋100 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲出現(xiàn)腫脹、變形和扭曲(圖4-C)，稀釋50 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲斷裂、分節(jié)(圖4-D)，稀釋20 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的菌絲頂端逐漸呈球狀膨大(圖4-E)，胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液處理的菌絲頂端破裂，原生質(zhì)發(fā)生滲漏(圖4-F)。

圖1 JN005 菌株產(chǎn)蛋白酶（A）、纖維素酶（B）、淀粉酶（C）和β-1, 3-葡聚糖酶（D）的檢測Fig.1.Test of protease(A), cellulase(B), amylase(C) and β-1, 3-glucanase(D) produced by JN005 strain.

圖2 JN005 菌株揮發(fā)性氣體(A)和胞外抗菌物質(zhì)(B)對稻瘟病菌的影響Fig.2.Effects of volatile compounds(A) and extracellular antimicrobial substances(B) of JN005 strain onM.oryzae.

圖3 不同處理對JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)抑制稻瘟病菌菌絲生長穩(wěn)定性的影響Fig.3.Effect of different treatments on activity of extracellular antimicrobial substances of JN005 strain againstM.oryzae.

圖4 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌菌絲生長的影響Fig.4.Effect of extracellular antimicrobial substances of JN005 strain on mycelia ofM.oryzae.

圖5 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌孢子的影響Fig.5.Effect of extracellular antimicrobial substances of JN005 strain on conidia ofM.oryzae.

在光學顯微鏡下觀察稻瘟病菌孢子，當對照組無菌水(圖5-A)和PBS 緩沖液(圖5-B)處理的稻瘟病菌孢子正常萌發(fā)時，胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的稻瘟病菌孢子發(fā)生異常：稀釋100 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子能夠萌發(fā)，芽管伸長，但其附著孢膨大(圖5-C)；稀釋50 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子萌發(fā)受阻，芽管短，其附著孢變大(圖5-D)，稀釋20 倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的孢子一端呈球型脹大(圖5-E)，胞外抗菌物質(zhì)粗提液原液處理的孢子變形，孢子兩端呈球型變大(圖5-F)。

2.4 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治效果

圖6 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防治效果(離體接種)Fig.6.Control efficacy of extracellular antimicrobial substances on rice leaf blast(indoor detached-leaf inoculation).

室內(nèi)湘晚秈12 號稻瘟病離體葉片接種表明，試驗組A 中，對稻瘟病效果最為顯著的是1500 倍75%三環(huán)唑(WP)稀釋液，發(fā)病率為20.0%；而100倍胞外抗菌物質(zhì)稀釋液的葉瘟發(fā)病率為34.1%，較接近發(fā)病率為30.4%的500 倍40%稻瘟靈(EC)稀釋液。試驗組B 中，稀釋1500 倍的75%三環(huán)唑(WP)發(fā)病率為23.0%，稀釋500 倍的40%稻瘟靈(EC)發(fā)病率為29.6%，稀釋100 倍的胞外抗菌物質(zhì)發(fā)病率為38.5%，三者差異顯著。根據(jù)圖6，發(fā)現(xiàn)先進行胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理后接種的葉片防稻瘟病效果整體高于先接種后進行胞外抗菌物質(zhì)粗提液處理的效果，說明提前施用JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液有利于水稻葉片對葉瘟的防治。

活體噴霧接種試驗表明，雖然100 倍胞外抗菌物質(zhì)稀釋液在試驗組C 中防效為75.3%，試驗組D中防效為71.5%，但都比不上1500 倍75%三環(huán)唑(WP)稀釋液和500 倍40%稻瘟靈(EC)稀釋液。各結(jié)果相比(圖7)，先噴施胞外抗菌物質(zhì)粗提液后接種的水稻防治葉瘟效果比先接種后噴施胞外抗菌物質(zhì)粗提液效果好，由此得出JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對水稻葉片具有保護作用。

3 討論

芽孢桿菌生物防治劑一直在植物病害綜合管理中扮演著非常重要的角色[18]。許多學者描述了枯草芽孢桿菌產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白、脂肽等代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)具有拮抗立枯絲核菌、灰霉病菌、黑條葉斑病菌等植物病原物生長的潛力[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌JN005 能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶和β-1, 3-葡聚糖酶，并且JN005 菌株的胞外抗菌物質(zhì)在平板上對稻瘟病菌有較好的拮抗活性。

圖7 胞外抗菌物質(zhì)對葉瘟的防效(活體接種)Fig.7.Control efficacy of extracellular antimicrobial substances on leaf blast(indoor live inoculation).

在提取JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)的過程中，探究了其物理和化學特性。Wang 等[23]報道枯草芽孢桿菌E1R-J 的抗菌蛋白EP-2 在40℃～100℃下孵育30 min 后均可檢測到抗蘋果樹腐爛病菌活性，且拮抗效果僅下降14.9%；同樣，本研究的枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)在0℃～100℃范圍內(nèi)抗稻瘟病菌的抑菌直徑未有大幅度變化，具有熱穩(wěn)定性。鄭小亮等[24]測試枯草芽孢桿菌Zl-2 抗菌蛋白酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果顯示過酸、過堿都會影響抗小麥赤霉病菌效果；而枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)在pH 2～11 范圍內(nèi)均表現(xiàn)出對稻瘟病菌有抑菌活性，但對pH 為12 處理最敏感。黃華毅等[25]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌STO-12 脂肽類物質(zhì)分別與多種蛋白酶混合和紫外線照射其抑菌活性沒有明顯減弱；反觀枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)只有經(jīng)蛋白酶K 處理后才保持其原有的抗菌效果，且紫外照射時間越長抑菌活性有所降低。張曉云等[26]的枯草芽孢桿菌CAB-1 蛋白粗提物在4℃條件下儲存120 d 后抑制番茄灰霉菌活性變化不大，枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)對稻瘟病菌也有相同的性質(zhì)。

在枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)影響植物病原菌孢子萌發(fā)和菌絲形態(tài)方面，劉燕等[27]報道枯草芽孢桿菌SL13 抗菌幾丁質(zhì)酶使得立枯絲核菌菌絲細胞壁解體、原生質(zhì)外泄、菌絲體破裂；吳艷清等[28]用顯微鏡觀察到枯草芽孢桿菌WL2 脂肽粗提物能夠抑制致病疫霉孢子萌發(fā)；本研究的枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)令稻瘟病菌菌絲和孢子都生長異常，且還能阻礙孢子萌發(fā)和附著孢形成，這可能會降低稻瘟病在水稻葉片上發(fā)生的幾率。

表1 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對葉瘟的防效(離體接種)Table 1.Control efficacy of crude extracts of JN005 extracellular antimicrobial substances on leaf blast(indoor detached-leaf inoculation).

表2 JN005 菌株胞外抗菌物質(zhì)粗提液對葉瘟的防效(活體接種)Table 2.Control efficacy of crude extracts of JN005 extracellular antimicrobial substances on leaf blast(indoor live inoculation).

黃娜等[29]的枯草芽孢桿菌胞外粗提蛋白防治蘋果炭疽病室內(nèi)活體試驗表明，先蛋白處理后接種試驗中，不稀釋的胞外蛋白的防效可達100%，在先接種后蛋白處理的試驗中，胞外蛋白的防效為55%。對于枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)防治水稻葉瘟而言，不論是離體還是活體接種試驗，提前施用胞外抗菌物質(zhì)能提高防治效果，可見胞外抗菌物質(zhì)一定程度上影響了葉瘟的發(fā)生，起到了保護水稻葉片的作用。稻瘟靈和三環(huán)唑是對抗稻瘟病最常用的兩種化學藥劑[30]，而接種實驗中，稀釋100倍胞外抗菌物質(zhì)粗提液效果比較接近40%稻瘟靈(EC)，不如75%三環(huán)唑(WP)?？莶菅挎邨U菌在農(nóng)業(yè)方面研究得十分廣泛，也被美國食品和藥物管理局認定為“公認安全”的微生物[31]?？紤]到枯草芽孢桿菌JN005 胞外抗菌物質(zhì)的實用性，將其純化鑒定后的物質(zhì)作為防治稻瘟病的生物防治劑，應用于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展是非常有潛力的。