施用韓國假單胞菌(Pseudomonas koreensis)CLP-7對連作煙田土壤質(zhì)量及微生物群落功能多樣性的影響

趙 倩,任廣偉 ,王 杰,王新偉, 韋建玉,王曉強(qiáng),盧燕回,陳 信,王 靜,*

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,煙草行業(yè)病蟲害監(jiān)測與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 青島 266101 2 廣西中煙工業(yè)有限公司, 南寧 530000 3 廣西壯族自治區(qū)煙草公司, 玉林 537000

煙草栽培需要特定的地理和氣候條件,受土地資源和水利條件制約,連作障礙嚴(yán)重[1]。連續(xù)種植導(dǎo)致土壤pH、化學(xué)性質(zhì)以及細(xì)菌豐度等顯著下降,土壤微生物多樣性各指標(biāo)均隨連作時間的延長而下降,而某些土傳根部病害,如煙草青枯病(Tobacco bacterial wilt)病原青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)在連作過程中積累,其數(shù)量與連作時間呈顯著正相關(guān)[2],且R.solanacearum具有嗜酸性[3],因此酸化植煙土壤中青枯病發(fā)生愈發(fā)嚴(yán)重。

土壤微生物多樣性,是指群落中的微生物種群類型和數(shù)量、種的豐度和均度以及種的分布情況[4],一直是生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一。土壤微生物與土壤pH調(diào)節(jié)和植物病害發(fā)生密切相關(guān)。首先,土壤pH值是土壤細(xì)菌群落變化的最佳預(yù)測因子,細(xì)菌相對豐度和多樣性受土壤pH強(qiáng)烈影響[5],已有研究表明,土壤酸化可引起青枯病的爆發(fā),酸性條件(pH 4.5—5.5)有利于病原菌的生長[6]；其次,土傳病害的發(fā)生與根際土壤微生物的數(shù)量關(guān)系密切,土壤微生物群體可在一定程度上抑制作物的土傳病害,Li等[7]通過“采用變性凝膠梯度電泳圖譜分析微生物群落多樣性和豐富度”研究,表明細(xì)菌群落多樣性與青枯病抑制性呈負(fù)相關(guān),也就是說,微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富,多樣性越高,對抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)。再次,增加土壤微生物功能多樣性可以創(chuàng)造有益于植物生長的條件[8],而微生物功能多樣性可以通過BIOLOG自動微生物鑒定技術(shù)分析。BIOLOG-ECO微平板是一種基于生物和生化特性的新方法,通過描述混合微生物群體水平的生理輪廓及群落功能多樣性,能夠快速地表征環(huán)境樣品的生態(tài)狀況,以反映微生物種群總體活性,表征其生理特征[9]。鄒春嬌等[10]通過BIOLOG-ECO技術(shù)闡明了黃瓜連作營養(yǎng)基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性特征：采用營養(yǎng)基質(zhì)栽培黃瓜,連作第5茬黃瓜產(chǎn)量、微生物碳代謝能力、微生物多樣性各項(xiàng)指標(biāo)及對單一碳源的高利用碳源數(shù)均顯著高于各茬次；在連作第11茬后微生物碳代謝能力顯著下降,微生物多樣性水平顯著降低,微生物對羧酸類碳源利用率明顯提高,微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生單一化現(xiàn)象。表征微生物活性的 AWCD 值和微生物功能多樣性指數(shù)雖然能反映土壤微生物的總體變化情況,并不能反映微生物群落代謝的詳細(xì)信息,但是微生物對不同碳源的利用可以反映微生物的代謝功能類群[11]。本研究通過BIOLOG-ECO技術(shù)研究施用CLP-7 后根際土壤微生物功能代謝多樣性變化,將土壤微生物碳源代謝利用情況與土壤中實(shí)際可利用碳源情況相聯(lián)系,根據(jù)碳源利用率了解根際微生物群落功能多樣性。目前,我國主產(chǎn)煙區(qū)土壤酸化趨勢明顯,且酸化土壤加重了煙草青枯病的發(fā)生和為害,針對有益微生物改善酸性植煙土壤質(zhì)量和土壤微生物群落功能多樣性的影響研究甚少。專利菌株P(guān).koreensisCLP-7(ZL.201710081711.X)[12]是本實(shí)驗(yàn)室自主分離的嗜酸性防病促生菌(PGPR,Plant Growth Promotion Rhizobacteria),對R.solanacearum具有較強(qiáng)的拮抗活性,該菌株在pH5.0—5.5條件下生物活性最強(qiáng),包括分泌蛋白酶、葡聚糖酶和解鉀能力,適用于酸性土壤條件下煙草真菌和細(xì)菌病害的生物防治(專利已授權(quán))。本試驗(yàn)在大田條件下將嗜酸性P.koreensisCLP-7 施入連作酸化植煙土壤中,以施菌后不同時間的根際土壤為研究對象,主要通過BIOLOG-ECO技術(shù)和主成分分析方法研究P.koreensisCLP-7對煙草根際土壤pH、養(yǎng)分含量、酶活活性以及微生物群落功能多樣性的影響,可以為合理施用嗜酸性P.koreensisCLP-7菌株、改善酸性土壤質(zhì)量和煙草青枯病綠色防控提供生態(tài)學(xué)方面參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試:CLP-7液體發(fā)酵液,有效濃度1×1011CFU/mL。

供試煙草：烤煙品種云煙87。

供試培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA,Nutrient Agar)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB,Nutrient Broth)、添加1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液的NA培養(yǎng)基[13]。

1.2 P.koreensis CLP-7 施用方法

試驗(yàn)地點(diǎn)與時間：本試驗(yàn)于2016年5—7月在湖南省張家界市永定區(qū)三家館巖水井(28°52′—29°48′N,109°40′—111°20′E)連作煙田進(jìn)行,供試煙田(100 m×80 m,每行240株,共72行)平分為2個處理區(qū),處理1是CLP-7,處理2是空白對照(CK, Check),每處理3次重復(fù),每重復(fù)2行,共400株。以云煙87為供試材料(生育期為出苗后45 d),初移栽后將CLP-7發(fā)酵液500倍稀釋后灌根做定根水,每株用量為100 mL,施用等量灌溉水還苗后(間隔10 d),再等量施用1次,共施用2次；CK處理同于上述施菌方法,施用等量灌溉水,試驗(yàn)田間管理同于大田標(biāo)準(zhǔn)管理。

1.3 根際土壤采集及處理

分別于第二次施菌后10 d(團(tuán)棵期)、30 d(旺長期)、50 d(成熟期)采用5點(diǎn)取樣法,如圖1所示,先確定處理小區(qū)對角線的中點(diǎn)作為中心取樣點(diǎn),再在對角線上選擇4個與中心樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)為取樣點(diǎn),處理組煙草,每點(diǎn)5棵煙株,共25株。根際土樣收集采用抖根法[14],即拔出根系,去除根圍土,將離主根和須根根軸表面數(shù)毫米范圍之內(nèi)附著的土壤抖到自封袋中,混合均勻共約100 g；另第50天同時采集CK處理土樣,采集方法同上,取好的土樣盡快置于-20 ℃保存、備用。

圖1 五點(diǎn)取樣法取樣示意圖

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1根際土壤pH測定

(1)室內(nèi)培養(yǎng)基pH測定：通過添加酸堿指示劑——溴麝香草酚藍(lán)測定平板pH變化。在添加1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液的NA平板上劃線接種CLP-7,于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48 h。

(2)煙田土壤pH測定：采用電位法[15]。稱取各處理(通過2 mm篩孔)風(fēng)干土樣5 g于50 mL燒杯中,加入12.5 mL無二氧化碳的水,攪拌5 min,靜置30 min,使用PHS-3E型pH計(jì)測定土壤pH,3次重復(fù)。

1.4.2根際土壤酶活活性與養(yǎng)分含量測定

土壤酶活測定均參照關(guān)松蔭[16]方法,包括土壤脲酶(S-UE,soil urease)、蔗糖酶(S-IA,soil invertase)和過氧化氫酶(S-CAT,soil catalase)；土壤養(yǎng)分含量測定均參照鮑士旦[17]方法：速效鉀(AK,Available K)用火焰光度計(jì)法測定、速效磷(AP,Available P)用鉬藍(lán)比色法測定、銨態(tài)氮(AN,Ammonium N)用靛酚藍(lán)比色法測定、硝態(tài)氮(NN,Nitrate N)用酚二磺酸比色法測定和有機(jī)質(zhì)(OM,Organic matter)用重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定。試驗(yàn)均為3次重復(fù)。

1.4.3BIOLOG-ECO分析根際土壤微生物群落功能多樣性

BIOLOG-ECO含有31種碳源,分為氨基酸類、糖類、羧酸類、胺類、雙親化合物及聚合物六類物質(zhì)[18]。ECO接種液制備方法：將土樣放在25 ℃條件下活化24 h,取5 g(當(dāng)量干重)土樣于100 mL三角瓶中,加入45 mL滅菌水,30 min后,用移液槍取1 mL泥漿到2 mL離心管中。在10000 r/min下離心20 min,棄去上清液,加1 mL生理鹽水,在振蕩器上振動5 min使之混勻；再于10000 r/min下離心20 min,重復(fù)2次,除去其中的碳源；棄去上清液,加1 mL生理鹽水,在振蕩器上振動5 min使之混勻,于2000 r/min下離心1 min。取上清液倒人裝有20 mL已滅菌生理鹽水(NaC1,0.85%)的離心管中,并使其OD590 nm維持在0.13±0.02,制備出接種液并移至儲液槽。使用8孔道排槍向ECO板培養(yǎng)基孔中加150 μL接種液,每個樣品3次重復(fù)。接種好的微孔板用自封袋封好,作好標(biāo)記后放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h使用BIOLOG微孔板讀數(shù)儀自動測定吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

(1)孔的平均顏色變化率：微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率[19](average well color development, AWCD)AWCD=∑(Ci-R)/n。式中,Ci為第i個非對照孔的吸光值,R為對照孔的吸光值,n為培養(yǎng)基碳源種類數(shù)(本研究中n=31)。

(2)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)[10]H=-∑(Pi-lnP)

式中Pi表示第i個非對照孔中的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值,即Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)。

(3)Simpson優(yōu)勢度指數(shù)[10]D=1-∑Pi2

(4)Pielou均勻度指數(shù)[10]J=H/lnR

式中,R為被利用的碳源總數(shù)。

(6)豐富度指數(shù)(R)[10],指被利用的碳源總數(shù)目,本研究中為每孔中(Ci-R)的值大于0.25的孔數(shù)。

主成分分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件的Data Reduction工具,多樣性指數(shù)、碳源相對利用率,采用168 h各施菌時間樣AWCD值計(jì)算[9],繪圖應(yīng)用Origin 9.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加P.koreensis CLP-7對培養(yǎng)基和根際土壤pH的影響

首先,CLP-7培養(yǎng)48 h后,添加指示劑的培養(yǎng)基由初始的黃色(pH 6.0)變?yōu)榫G色(>pH 7.0)(圖2)說明該菌株的生長代謝過程能引致培養(yǎng)基pH明顯升高。其次,田間試驗(yàn)(3次重復(fù))結(jié)果顯示(圖3),隨著施用CLP-7 時間的增加,根際土壤pH發(fā)生較明顯的變化,第一次采樣(團(tuán)棵期,施菌10 d)的根際土壤pH是5.1±0.0,處理間差異顯著(P<0.05)；第二次采樣(旺長期,施菌30 d)的根際土壤pH是5.3±0.1；第三次采樣(成熟期,施菌50 d)的根際土壤pH升高至5.4±0.0,CK處理的pH是5.2±0.1,各處理與對照組差異顯著(P<0.05)。說明施菌后,土壤pH呈升高趨勢。

圖2 CLP-7劃線前后添加指示劑培養(yǎng)基的顯色變化

圖3 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤pH變化

2.2 P. koreensis CLP- 7對根際土壤酶活性的影響

如表1所示,CLP-7處理對根際土壤酶活性存在不同程度的影響。施菌后10 d、30 d和50 d時,脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性均呈先上升后下降的趨勢,其中,蔗糖酶、脲酶活性高于CK,30 d時活性最高,分別比CK增加5.8%和35.5%,處理間差異顯著；過氧化氫酶活性在整個取樣時間內(nèi)均低于CK。

表1 CLP-7對煙草根際土壤酶活性的影響

2.3 P.koreensis CLP-7對根際土壤養(yǎng)分含量的影響

由表2數(shù)據(jù)可知,P.koreensisCLP-7可以不同程度提高土壤養(yǎng)分含量。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在施菌后10 d最高,分別比CK增長34.9%和36.3%；然后隨施菌時間增加而下降,處理間差異顯著；速效鉀含量隨施菌時間增加呈先上升后下降趨勢,但3個處理的含量均高于CK,處理間差異顯著；且30 d時,速效鉀含量最高,比CK增加13.4%；CLP-7對根際土壤有效磷含量影響較大,施菌10 d時,根際土壤有效磷含量最高,比CK增加394.3%,然后逐漸下降,至50 d時,有效磷含量仍比CK增加110.0%,處理間差異顯著；根際土壤有機(jī)質(zhì)含量增加明顯,所有取樣時間的土壤有機(jī)質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢,且均高于CK處理,分別增加了11.1%,19.0 %和16.7%,30 d時含量最高。

表2 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤養(yǎng)分含量變化

2.4 P.koreensis CLP-7對根際土壤微生物代謝功能多樣性的影響

2.4.1根際土壤微生物代謝功能的變化特征及主成分分析

由圖4可以看出,隨著培養(yǎng)時間的增加,根際土壤中的微生物活性不斷升高,自24 h起AWCD值迅速升高,168 h后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。對比不同施菌時間根際土壤微生物AWCD值發(fā)現(xiàn),其變化趨勢為30 d>50 d>CK>10 d,即施菌30 d時,AWCD值達(dá)到最高值1.3,比CK增加371.6%；施菌后50 d時,AWCD值下降為0.67,但仍比CK增加1.23%,施菌10 d時的AWCD值最小,為0.19,比CK減少0.38%。上述結(jié)果說明, CLP-7能顯著提高根際土壤微生物對碳源的利用率。

圖4 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤微生物的AWCD值變化

對不同處理根際土壤培養(yǎng)168 h后各碳源AWCD值進(jìn)行主成分分析,在31種因子中提取3個主成分因子,第1、2、3主成分得分貢獻(xiàn)率分別為49.0%、36.9%、11.3%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)97.3%,其余各主成分的貢獻(xiàn)率很小,因此將前3個主成分得分作圖,來表征施菌后不同時間根際土壤微生物碳源代謝特征。結(jié)果如圖5所示,10 d在PC1、PC2上得分最高,說明施菌10 d煙株土壤微生物碳源利用影響最大；反之,30 d和CK得分相近且較小,施菌30 d后與CK處理土壤微生物對碳源利用能力相似程度較高。

圖5 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤微生物碳源代謝主成分分析

2.4.2P.koreensisCLP-7對根際土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

施用CLP-7 后,根際土壤微生物Shannon-wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)、Richness Index豐富度指數(shù)以及Mclntosh指數(shù)在不同取樣時間內(nèi)發(fā)生了不同程度的變化,從表3可以看出,Shannon-wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)和Mclntosh指數(shù)隨著施菌時間的增加呈升高趨勢,施菌30 d時達(dá)到最高,分別為3.3、1.0、26.7和8.0,比CK分別增長16.5%、3.2%、53.7%和27.5%,處理間差異顯著；而Pielou指數(shù)隨著施菌時間的增加變化不明顯,與CK基本持平。

表3 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

2.4.3P.koreensisCLP-7對根際土壤微生物利用碳源能力的影響

BIOLOG ECO微孔板含有31種碳源,基于碳源官能團(tuán)的不同,將其分為6類,分別是氨基酸類、羧酸類、胺類、聚合物類、雙親化合物類和糖類。本試驗(yàn)各處理土壤微生物群落對6類碳源的相對利用率如圖6所示,CLP-7對根際土壤微生物碳源利用有不同程度的影響。隨著施菌時間的增加,根際土壤微生物對碳源的利用率逐漸增強(qiáng),尤其是對羧酸類和糖類碳源的利用率較高,均超過50%,但利用率也存在明顯差異,對羧酸和糖類碳源利用率強(qiáng)弱順序分別為10 d>50 d>CK>30 d和50 d>10 d>30 d>CK。施菌10 d時,土壤微生物對土壤中羧酸類碳源相對利用率達(dá)到100%；施菌50 d,土壤微生物對糖類、胺類和聚合物類碳源相對利用率均達(dá)到100%,氨基酸類和雙親類碳源相對利用率在施菌后30 d達(dá)到最高,分別為70.3%和100%。

圖6 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤微生物對6類碳源相對利用率

如圖7所示,碳源低利用率預(yù)示著微生物對其利用能力的衰退,碳源高利用率表明微生物對其利用需求較強(qiáng)。施用CLP-7 后,土壤微生物對31種碳源的利用能力顯著提高,變化規(guī)律為30 d>CK>50 d>10 d,與CK差異顯著。施菌50 d時,碳源基本被土壤中微生物完全利用。另外,隨著施菌時間增加,土壤微生物對大部分氨基酸類碳源(L-精氨酸、L-天冬酰氨酸、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸)、部分羧酸類碳源(D-葡萄氨酸、D-半乳糖醛酸、2-羥苯甲酸)、部分聚合物類(吐溫40、肝糖)、雙親類化合物碳源的丙酮酸甲酯和大部分糖類碳源(α-D-乳糖、i-赤藻糖醇、N-乙酰基-葡萄胺)代謝活性有明顯的提高,而對氨基酸類碳源的L-蘇氨酸、羧酸類的D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸和衣康酸、胺類碳源中的苯乙胺和部分糖類碳源,包括葡萄糖-1-磷酸、D,L-α-甘油和β-甲基-D-葡萄糖苷的代謝活性降低。

圖7 CLP-7不同處理時間煙草根際土壤微生物對31種碳源利用率

3 結(jié)論與討論

無論是從土壤pH、養(yǎng)分、酶活性的物質(zhì)代謝,還是從土壤微生物對碳源的利用率和土壤微生物功能多樣性的角度出發(fā),P.koreensisCLP-7有助于改善連作酸化土壤質(zhì)量,包括提高土壤pH,增加土壤速效鉀、有效磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量,提高土壤脲酶和土壤蔗糖酶活性,增強(qiáng)土壤微生物功能多樣性,提高對煙草青枯病的防治和促生效果[12]。

已有研究表明,長期連續(xù)耕作可導(dǎo)致嚴(yán)重的土壤酸化、營養(yǎng)失衡和根際微生態(tài)環(huán)境惡化,如植煙土壤緩解pH的能力降低、土壤養(yǎng)分含量發(fā)生非均衡變化等；當(dāng)連作達(dá)到一定年限時,土壤pH顯著下降,有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀和有效磷含量也出現(xiàn)不同程度的降低[19]。而土壤細(xì)菌群的組成、相對豐度和多樣性是由土壤pH、土地利用和恢復(fù)等因素決定的[5]。本試驗(yàn)在室內(nèi)添加指示劑培養(yǎng)和田間試驗(yàn)條件下,驗(yàn)證了P.koreensisCLP-7能一定程度提高其生長環(huán)境的pH,施用于連作導(dǎo)致的酸化植煙土壤后,煙草根際土壤pH呈升高趨勢,施菌50 d時土樣的pH為5.4,高于CK(pH=5.2),說明P.koreensisCLP-7可通過生物修復(fù)在一定程度上改善土壤酸化。沈靈鳳等[20]研究表明,土壤硝態(tài)氮含量與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,硝態(tài)氮在土壤中大量累積會造成土壤pH下降。而本研究中,施菌后土壤中硝態(tài)氮含量呈下降趨勢,進(jìn)一步驗(yàn)證了CLP-7 減少了硝態(tài)氮在土壤中的累積,從而提高土壤pH。因此,在酸性土壤中施用嗜酸性P.koreensisCLP-7 可以通過減少硝態(tài)氮的積累緩解土壤酸化,創(chuàng)造良好的、適宜煙株生長而不利于青枯病等根莖病害發(fā)生的土壤生態(tài)環(huán)境。

據(jù)Luo等[21]研究發(fā)現(xiàn),土壤pH與土壤酶活性正相關(guān)且隨著連作時間的增加,pH下降的同時土壤酶活性也呈下降趨勢。土壤脲酶是一種酰胺酶,是土壤中唯一一種能將尿素轉(zhuǎn)化為有效氮的酶[22],能促進(jìn)土壤尿素水解生成氨,而氨是植物重要的氮源之一,間接為植物提供氮源。除此之外,土壤脲酶還可以催化土壤有機(jī)磷化合物的礦化,直接影響土壤中有機(jī)磷的分解、轉(zhuǎn)化及其生物有效性[23]。而本研究發(fā)現(xiàn)隨CLP-7處理時間的延長,土壤脲酶活性顯著提高,在施菌30 d達(dá)到最高值,且施菌10 d時,土壤中銨態(tài)氮含量遠(yuǎn)高于對照組,煙草根際土壤中可溶性磷含量也隨施菌時間增加呈上升趨勢,由此可知CLP-7可通過提高土壤脲酶的活性將土壤中的尿素轉(zhuǎn)化成氨,同時將土壤中難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化成可溶性磷供煙株吸收,提高植物對土壤中氮和磷元素的利用,從而促進(jìn)植物生長。與徐欣等[24]研究的土壤脲酶活性與氮磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系基本一致。除此之外,在本研究中,CLP-7 處理的根際土壤中蔗糖酶和過氧化氫酶活性以及養(yǎng)分硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均顯著提高。而土壤蔗糖酶又稱轉(zhuǎn)化酶,是一種可以把土壤中高分子量蔗糖分解成能夠被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶,可為土壤生物體提供充分能源,通常情況下,土壤肥力越高,蔗糖酶活性越強(qiáng),它不僅能夠表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度,也可以作為評價土壤熟化程度和土壤肥力水平的一個指標(biāo)[25]；過氧化氫酶主要分解土壤中的過氧化氫,降低土壤中過度累積的過氧化氫對植物根系的危害。土壤蔗糖酶、過氧化氫酶活與土壤中全氮含量極相關(guān)。CLP-7菌株不但可以通過影響土壤酶活改善土壤中氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素的含量,同時其自身也具有解鉀特性[12]。Viruel等[26]指出,韓國假單胞菌SP28具有溶磷作用以及促進(jìn)玉米生長特性。由此可知,CLP-7可通過提高酸化土壤酶活和解磷解鉀增加氮磷元素含量,進(jìn)而促進(jìn)植株的生長發(fā)育,抑制青枯病的發(fā)生。

一般來說,土壤有機(jī)質(zhì)含量的多少,是土壤肥力的一個重要指標(biāo),另外,據(jù)吳迪等[27]研究發(fā)現(xiàn),根際微生物豐富度和多樣性指數(shù)均與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)中CLP-7菌株能顯著提高根際土壤有機(jī)質(zhì)含量,施菌后三個時間處理比CK處理分別增加約62.9%、109.2%和93.8%,分析其原因可能是土壤有機(jī)質(zhì)含量的升高,有利于某些微生物數(shù)量的增加,進(jìn)而能提高根際土壤微生物群落的豐富度,本試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論,但P.koreensisCLP-7可以促進(jìn)哪類微生物數(shù)量的增加,還有待進(jìn)一步研究。

植物根際土壤微生物是根部最活躍的部分,能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化[28]。通過BIOLOG-ECO微平板檢測獲得的AWCD值提供不同微生物對相同碳源利用的差異性,反映了微生物對碳源的利用能力,從功能代謝方面顯示了微生物群落功能多樣性,用于描述土壤微生物代謝活性[10]。除此之外,土壤微生物優(yōu)勢度越大,則其群落結(jié)構(gòu)受優(yōu)勢種的影響越大,若其物種多樣性指數(shù)同時隨之增大,則說明該群落結(jié)構(gòu)越趨于穩(wěn)定[27],通常土壤微生物優(yōu)勢度由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)、Mclntosh指數(shù)和Pielou指數(shù)體現(xiàn)。而本試驗(yàn)中CLP-7處理組根際土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著提高,分析其原因可能是CLP-7有利于根際土壤中微生物數(shù)量和微生物群落豐富度的增加,進(jìn)而提高土壤有機(jī)質(zhì)含量,本推論通過BIOLOG-ECO微平板檢測獲得的AWCD值和土壤微生物多樣性指數(shù)變化得到驗(yàn)證。

除了土壤微生物的變化,有機(jī)酸類煙草根系分泌物在R.solanacearum侵染煙草過程中也扮演著重要的作用。前期研究鑒定出了肉桂酸、延胡索酸、肉豆蔻酸能夠作為化學(xué)信號物,誘導(dǎo)R.solanacearum的運(yùn)動趨化活性,刺激生物膜的形成,促進(jìn)煙草青枯病發(fā)生,同時R.solanacearum對多種氨基酸(甘氨酸)、糖類(半乳糖)和有機(jī)酸(檸檬酸)具有特殊的吸引力[29]。本研究還發(fā)現(xiàn),隨著施用CLP-7 時間的增加,根際微生物對羧酸類、雙親化合物類、聚合物類和糖類利用率明顯提高,說明偏好羧酸類、雙親化合物類、聚合物類和糖類微生物種群得到富集,微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生偏單一化現(xiàn)象。糖類、羧酸類和氨基酸類碳源與根系分泌物關(guān)系最密切[30],本研究對土壤微生物代謝功能主成分分析明確了施菌10 d—30 d期間,煙株根際土壤中微生物對碳源利用差異顯著,主要是氨基酸類、羧酸類和糖類碳源,與孫家駿等[31]研究的施用生物有機(jī)肥對土壤微生物群落功能多樣性試驗(yàn)結(jié)果一致,即土壤微生物群落主要是利用碳水化合物、氨基酸和羧酸。再加上R.solanacearum對這三種碳源有特殊吸引力,因此在施用P.koreensisCLP-7后,喜好氨基酸類、羧酸類和糖類碳源的土壤微生物增多,土壤中這三類碳源被徹底利用,與R.solanacearum競爭氨基酸類、羧酸類和糖類碳源,從而降低青枯病的發(fā)生,解釋了前期試驗(yàn)結(jié)果,即在酸性土壤條件下,P.koreensisCLP-7能推遲煙草青枯病發(fā)病10 d,對煙草青枯病的防效為85.6%,且高于中性土壤條件下防效71.6%[12]。

綜上所述,P.koreensisCLP-7能夠明顯提高土壤pH和酶活性,增加土壤養(yǎng)分含量和土壤微生物群落功能多樣性,進(jìn)而改善酸化植煙土壤質(zhì)量,在微生物修復(fù)酸化土壤和減輕根莖病害發(fā)生的煙草綠色防控中具有較大的應(yīng)用潛力。