硼砂對斑馬魚發(fā)育的影響*

金 鑫 周鈺林 陳錫強(qiáng) 張立濤 葛 順△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826；2山東省科學(xué)院生物研究所，濟(jì)南 250014)

據(jù)《本草綱目》記載，硼砂具有清涼解毒、消積塊和除痰熱等功效，是我國的一味傳統(tǒng)中藥。硼砂對乳腺癌、食管癌、宮頸癌和陰道癌等具有一定的療效[1]。但是硼砂對人體具有一定的損傷，進(jìn)入人體后會與胃酸反應(yīng)生成硼酸不易排出[2]，易蓄積中毒，表現(xiàn)為頭痛、頭暈，嚴(yán)重可致死亡[3]。目前，硼砂對大鼠、果蠅、鯽魚的毒性研究已見報(bào)道[4-6]，但是未有其發(fā)育毒性方面的研究。

斑馬魚和人類有87%的基因同源性，且在生理功能、發(fā)育過程、器官構(gòu)造等方面與哺乳動物非常接近[7]，同時(shí)斑馬魚具有胚胎透明易于觀察、給藥劑量少和體外受精等特點(diǎn)[8-9]，是理想的模式生物，而且因?yàn)闇p少、替代和優(yōu)化等動物實(shí)驗(yàn)原則，實(shí)現(xiàn)保護(hù)動物福利和減少哺乳動物等較高級實(shí)驗(yàn)動物的使用量，斑馬魚發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)替代哺乳動物模型已廣泛應(yīng)用于藥物的發(fā)育毒性與致畸性研究[10-11]。本研究以斑馬魚為研究對象，探討硼砂對斑馬魚的發(fā)育毒性，為硼砂的毒理機(jī)制提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

野生型AB品系斑馬魚18條(4月齡)和肝臟轉(zhuǎn)基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚18條(4月齡)，由山東省科學(xué)院生物研究所斑馬魚藥物篩選平臺提供。

1.2 試劑與儀器

硼砂(中國食品藥品檢定研究院，批號：190166-201601)，錫紙遮光室溫保存，用斑馬魚養(yǎng)殖水溶解稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用；三卡因(Sigma公司)，用蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.16%的溶液，放4℃冰箱保存；斑馬魚養(yǎng)殖水，19.26μg/ml MgSO4、12.67μg/ml KCl、44.4μg/ml CaCl2和292.22μg/ml NaCl[12]。

斑馬魚飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)；光照培養(yǎng)箱HPG280BX(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；體視熒光顯微鏡SZX16(Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1魚卵收集 挑選健康性成熟的野生型AB品系和肝臟轉(zhuǎn)基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚按雌雄比例1∶2放入交配缸中，用隔板隔開，16h后抽隔板，2h后即可收集魚卵，移入盛養(yǎng)殖水的魚缸中，滴亞甲基藍(lán)溶液，將魚缸放光照培養(yǎng)箱(溫度：28℃；光周期：14h光照，10h黑暗)培養(yǎng)。

1.3.2發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn) 將受精6h的野生型AB品系斑馬魚胚胎在顯微鏡下觀察，將發(fā)育正常的胚胎隨機(jī)轉(zhuǎn)入12孔板中，每孔20個(gè)胚胎，3ml不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)孔。硼砂濃度梯度設(shè)為0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml，不加硼砂的設(shè)為空白對照。每日對斑馬魚胚胎或幼魚進(jìn)行觀察并記錄數(shù)據(jù)，將死亡的胚胎或幼魚即時(shí)清除，以受精后小時(shí)(hpf)為時(shí)間段，在受精48h更換新的硼砂濃度的養(yǎng)殖水。每天對斑馬魚的自主活動次數(shù)、心率、孵化數(shù)、畸形數(shù)和死亡數(shù)進(jìn)行記錄。利用肝臟熒光且發(fā)育正常的肝臟轉(zhuǎn)基因T3(lfabp:EGFP)品系斑馬魚幼魚研究硼砂對肝臟發(fā)育的影響，在顯微鏡下挑選發(fā)育72h的健康幼魚，將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入12孔板中，每孔20個(gè)胚胎，3ml不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)孔。硼砂濃度梯度為0.1mg/ml、0.3mg/ml和0.5mg/ml，不加硼砂的設(shè)為空白對照。每天將死亡的幼魚即時(shí)清除并在給藥后48h更換新的不同硼砂濃度的養(yǎng)殖水。每天用三卡因溶液將斑馬魚幼魚麻醉，在體視熒光顯微鏡下對斑馬魚幼魚進(jìn)行拍照并觀察綠色熒光肝臟面積大小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 硼砂對斑馬魚胚胎自主活動的影響

斑馬魚胚胎24hpf，隨著硼砂濃度的升高斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)逐漸降低，其中0.9mg/ml硼砂處理組[(1.72±1.99)次/min]斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)不足空白對照組[(3.94±2.21)次/min]的50%，具有顯著性差異(P<0.01)。見圖1。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.2 硼砂對斑馬魚胚胎孵化率的影響

空白對照組48hpf的孵化率為(98.33±2.89)%，硼砂處理組(0.3mg/ml、0.6mg/ml和0.9mg/ml)的胚胎已全部孵化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？瞻讓φ战M和硼砂處理組72hpf的斑馬魚胚胎均全部孵化。見圖2。

圖2 硼砂對斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.3 硼砂對斑馬魚幼魚心率影響

硼砂各處理組和空白對照組受精48h后的斑馬魚胚胎在心率上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；72、96hpf隨著硼砂濃度的逐漸升高，斑馬魚幼魚的心率逐漸降低，硼砂各處理組顯著低于空白對照組(P<0.01)。見圖3。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.4 硼砂對斑馬魚幼魚畸形率的影響

隨著硼砂濃度的升高，96hpf后的斑馬魚胚胎畸形率逐漸上升(圖4)，0.3、0.6mg/ml硼砂處理組與空白對照組在斑馬魚胚胎畸形率上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，0.9mg/ml硼砂組斑馬魚幼魚的畸形率達(dá)到了70%(P<0.01)。斑馬魚幼魚的畸形主要表現(xiàn)為卵黃囊水腫、心包水腫和脊柱彎曲等癥狀(圖5)。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

注：YSE.卵黃囊水腫；PE.心包水腫；SC.脊柱彎曲。

2.5 硼砂對斑馬魚死亡率的影響

硼砂各處理組和空白對照組的斑馬魚胚胎在24、48、72hpf死亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。0.9mg/ml硼砂組斑馬魚胚胎96hpf死亡率顯著性升高(P<0.01)，達(dá)到了50%以上；120hpf死亡率幾乎達(dá)到了100%(P<0.01)。見圖6。

注：與空白對照組相比，*P<0.01

2.6 硼砂對斑馬魚肝臟發(fā)育的影響

斑馬魚胚胎96hpf，硼砂各處理組和空白對照組肝臟大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，120、144hpf，0.5mg/ml硼砂組斑馬魚肝臟明顯小于空白對照組(P<0.01)。見圖7，8。

圖7 斑馬魚幼魚肝臟熒光信號圖

注：與空白對照組相比，*P<0.01

3 討論

硼砂又叫月石，為硼酸鹽類硼砂族礦物，其功效為清熱消痰、解毒防腐，常用于治療咽喉腫痛、口舌生瘡、目赤翳障胬肉等。在脊椎動物發(fā)育過程中，硼發(fā)揮著重要的作用，硼的缺乏會導(dǎo)致妊娠起始和胚胎發(fā)育有關(guān)的基因下調(diào)，導(dǎo)致胚胎發(fā)育早期不良。但是高濃度的硼會干擾雞和大鼠某些器官的發(fā)育[13]。在利用斑馬魚模型對硼砂發(fā)育毒性進(jìn)行研究中，斑馬魚胚胎自主活動次數(shù)、孵化率、心率、畸形率、畸形形態(tài)和死亡率等是重要的評價(jià)指標(biāo)[14]。高劑量硼可降低雞胸肌肉纖維中葡萄糖、糖原、乳酸和ATP的濃度，破壞肌纖維中線粒體結(jié)構(gòu)，影響其能量代謝[15]。本文結(jié)果顯示，斑馬魚的自主活動次數(shù)隨硼砂濃度的升高逐漸降低，硼砂可降低斑馬魚的自主活動次數(shù)和心率，增加死亡率和畸形率(心包水腫，卵黃囊水腫和脊柱彎曲)，高濃度的硼砂在受精120h死亡率達(dá)到了98.3%，在受精120h和144h后，0.5mg/ml硼砂處理組斑馬魚肝臟明顯小于空白對照組，提示高濃度的硼砂可能破壞斑馬魚體內(nèi)的能量代謝，這與雞中的研究結(jié)果一致。此外，高劑量的硼可能引起細(xì)胞渾濁腫脹[16]，而斑馬魚的畸形是以卵黃囊水腫和心包水腫為主。硼誘發(fā)Gcn2激酶催化eIF2α的磷酸化，干擾翻譯的起始，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的抑制作用[17]。因此，斑馬魚心臟和肝臟等器官的發(fā)育受到了抑制。

綜上所述，高濃度的硼砂在斑馬魚發(fā)育過程中會減少其自主活動次數(shù)，增加其畸形率和死亡率，同時(shí)抑制心臟和肝臟的發(fā)育，具有發(fā)育毒性，但是當(dāng)硼砂濃度低于0.3 mg/ml時(shí)對斑馬魚發(fā)育幾乎沒有影響，可以作為其安全濃度。在未來，需要進(jìn)一步對硼砂毒性作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析，確定其毒性機(jī)理，為其進(jìn)一步的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。