CPP-ICA復合骨支架生物相容性的體外實驗研究

李富琴，石永新，宋 暉

[中國科學院大學深圳醫(yī)院(光明),廣東 深圳 518106]

骨缺損的修復是臨床上常見的治療難題，由于受自體骨移植諸多并發(fā)癥的限制，目前越來越多的學者將研究重點放在了骨支架材料的研發(fā)上[1]。良好的骨支架材料需要滿足良好的生物相容性、骨誘導性、骨傳導性，無致畸致癌，具有一定要求的機械性能及無不良反應等，其中最重要的特征是具有良好的生物相容性[2]。聚磷酸鈣(calcium polyphosphate，CPP)是近年來發(fā)現的一種新型材料，具有良好的骨誘導性，優(yōu)良的可控降解性及體內生物相容性等諸多優(yōu)點[3]，成為骨修復材料的理想材料。淫羊藿苷(ICA)是目前常用的成骨誘導劑，近年來的研究成果肯定了ICA能夠誘導間充質干細胞成骨分化,可用于骨組織工程中促進骨缺損的修復[4]。二者結合制成復合骨支架后，其生物相容性如何，尚未見報道。

1 材料與方法

1.1材料制備

1.1.1復合骨支架的制備：本次研究經過我院醫(yī)學倫理委員會同意。CPP(聚磷酸鈣,批號CAS10031-30-8,南京化學試劑股份有限公司)和ICA(淫羊藿苷, 批號YYH-120318,西安昊軒生物有限公司)。將Ca(H2PO4)2·H2O在500℃保溫后再升溫至熔融，淬冷后制得CPP非晶燒料，用無水乙醇清洗，烘箱烘干，研磨過篩,選取粒徑范圍為70～100 μm的CPP 非晶粉末用于實驗燒料。將上述制得的CPP燒料放入電阻爐中二次燒結,再緩慢升溫至580℃后保溫一段時間, 然后冷卻得到CPP 骨支架材料,按4∶1質量比例加入淫羊藿苷;選用25%檸檬酸+68%水+5%檸檬酸鈉作為固化液；固液比例為3∶1，調制成糊，倒進直徑10 mm、厚2 mm的自制模型，自然干燥后，脫模，得到所需CPP-ICA復合骨支架模塊。將該復合骨支架用蒸餾水振蕩并清洗10 min，高溫高壓(121℃，20 min)的條件下滅菌、烘干、備用。

復合骨支架大體觀察外觀白色，表面不光滑，整體呈均勻細小的蜂窩狀空隙結構。電鏡下見支架呈現結構均勻的蜂窩狀結構，有支架小梁連接空隙結構，微孔結構成類圓形，孔徑大小相對較均勻。支架的孔徑約為110～160 μm，孔隙率為(71.69±0.86)%，孔隙密度為(0.24±0.07)g/cm3。支架具有良好的親水性，吸水后復合骨支架均勻膨大，體積增加。經力學測試，CPP/ICA 復合骨支架具有良好的力學性能,可以滿足實驗用大白兔體內大段骨缺損移植的生物力學要求[5]。

1.1.2復合骨支架浸提液的制備:取備用的復合骨支架材料，浸提介質為含體積分數為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，按1 g∶10 ml比例，5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h,離心后取上清液,過濾并除菌,保存在100 ml瓶中,在4℃保存，并在24 h內使用。

1.2方法

1.2.1成骨細胞MG63與CPP-ICA復合骨支架共同培養(yǎng):取備用的復合骨支架，PBS反復沖洗3次，在DMEM培養(yǎng)液中浸泡1 d，置入24孔板，每孔1塊，取MG63細胞懸液20 μl，濃度為1×106個/ml，接種在復合骨支架模塊表面，每種模塊設置6個復孔，置入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下孵育，4 h后，加入DMEM培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)孵育后每24小時更換培養(yǎng)液，不同時間點觀察細胞形態(tài)學改變，拍照記錄。

1.2.2成骨細胞與CPP-ICA復合骨支架浸提液共同培養(yǎng):以5×104細胞/ml的濃度制備細胞懸浮液，接種在一個有效孔96的孔板上，每孔100 μl，在5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h。定義實驗組(骨骼材料骨提取物)、陽性對照組(6.4 g/L苯酚溶液)、陰性對照組(10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，各組6個復孔，吸出原培養(yǎng)液，每孔加入100 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24小時更換一次細胞懸浮液。觀察和拍攝每組在不同時間點的細胞形態(tài)和細胞生長情況。CPP-ICA復合骨支架毒性的評估標準如下：①無細胞毒性：細胞貼壁附著好，形態(tài)為三角形或梭形，無異常形態(tài)；②輕度細胞毒性作用：細胞貼壁黏附好，部分細胞濃縮，少于1/3，偶爾有懸浮細胞；③中度細胞毒性作用：細胞貼壁黏附較差，細胞固縮超過1/3，有細胞懸??；④重度細胞毒性作用：細胞不貼壁及生長，超過90%的細胞已懸浮死亡。

1.2.3細胞活性檢測:用MTT法檢測細胞活性。取5×104細胞/ ml的細胞懸液,接種于3塊96有效孔板，每有效孔接種100 μl，在5%CO2培養(yǎng)箱37℃條件培養(yǎng)24 h后，設置6個復孔，并且抽吸培養(yǎng)物的原溶液，每孔100 μl。余孔繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在24 h、48 h、72 h更換懸液1次。在24 h、48 h和72 h后取出處理后的其中一塊培養(yǎng)板，將MTT 20 μl添加到每個孔中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸出原始培養(yǎng)溶液，加入100 μl DMSO，將溶液振蕩10 min。通過酶標儀測量吸光度A值，取平均值。 計算細胞增殖率RGR(%)，RGR=CPP-ICA復合骨支架浸提液A均值/陰性對照組A均值×100%。通過細胞毒性分類方法進行標記[2]，見表1。

表1 細胞毒性分類方法標記表

2 結果

2.1MG63與CPP-ICA復合骨支架共培養(yǎng)后細胞形態(tài)學觀察:共培養(yǎng)第4天后，觀察MG63細胞和CPP-ICA復合骨支架接觸生長情況，見邊緣均接良好，MG63細胞緊緊貼附復合骨支架邊緣生長，細胞多呈梭形，形態(tài)正常。

2.2MG63細胞與CPP-ICA復合骨支架浸提液共培養(yǎng)后細胞形態(tài)學觀察:在繼續(xù)培養(yǎng)的第24小時,第48小時,第72小時，實驗組的細胞貼壁生長良好,生長快，狀態(tài)良好，數量逐步增加，細胞形態(tài)呈長梭形、三角形及多邊形，其中以長梭形細胞居多，與陰性對照組細胞情況基本相似，而陽性對照組細胞形態(tài)異常，數量顯著減少，細胞固縮，部分細胞逐漸崩解。見圖1。

圖1 圖a、b、c分別為培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后實驗組細胞形態(tài)學改變圖，如圖可見細胞體積增大，胞漿豐富，數量迅速增長，形態(tài)呈梭形和多邊形，細胞突起較前增多，細胞聚集成簇或融合成片

2.3各組MG63細胞生長和增殖情況比較:各組MG63細胞生長和增殖情況見表2及表3。

表2 不同時間點時各組細胞光吸收值(A值)比較

表3 不同時間點各組的RGR值及細胞毒性等級

由表2可見，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，陰性對照組和實驗組的A值無明顯差異(P>0.05)；陽性對照組A值逐漸降低，培養(yǎng)24 h，陰性對照組和實驗組A值高于陽性對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在培養(yǎng)48 h及72 h時，陽性對照組A值均明顯低于實驗組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。由表3可見，在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，實驗組RGR值高于100%，細胞毒性等級為0級。

3 討論

骨缺損是臨床上常見的疾病，由于受自體供骨量有限及供骨區(qū)并發(fā)癥等所限[6]，骨修復材料成為近年來研究的熱點。骨組織支架工程目前被認為是治療骨缺損這一世界性難題的首選方法[7]。骨支架需要滿足良好的骨誘導性及傳導性、生物相容性及足夠的力學性能、可提供成骨細胞或直接成骨、形成良好的材料-骨組織界面等[8]。其中良好生物相容性是生物材料最基本的要求，細胞毒性為3～5級的材料為生物相容性不合格[2]。由于單一的骨修復材料很難同時滿足以上要求，復合骨支架成為今年來研究的熱點[9]。有學者將骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞等種子細胞與骨支架復合，經骨誘導后分化為成骨細胞，以增強骨支架的成骨性[10]。

本研究選用CPP作為骨支架，CPP是一種新型的可降解的骨修復材料[11]，CPP具有長鏈結構，在動物體內10 d便可逐漸降解分化，誘導骨質形成,且主鏈依靠大量P-O鍵的連接，類似于ATP中高能磷酸鍵[12]。P-O鍵降解斷鏈可釋放出能量供細胞活動，降解產物的成分為游離的鈣離子、磷離子及可溶性磷酸鹽、鈣鹽，無局部炎性反應。在組織工程研究常作為骨支架材料使用，在骨組織的缺損修復方面具有良好的應用前景[13]。ICA能夠促進BMSCs的增殖及成骨分化。其具有來源廣泛,提取工藝簡單,獲取便捷，費用低廉等優(yōu)點,是一種很有應用前景的促進骨缺損修復的中藥單體。近年來的研究顯示，ICA能誘導骨髓間充質干細胞成骨分化,促進成骨細胞，抑制破骨細胞，從而促進骨缺損的修復[14-15]。毛勇等應用淫牟蕾昔與β-磷酸三鈣復合后修復兔橈骨骨缺損，12周后骨缺損完全愈合[16]。李慕勤等實驗發(fā)現羥基磷灰石-絲素蛋白/殼聚糖/淫羊藿具有更好地促進成骨細胞增殖的作用，其作為骨組織工程支架材料的可行性強[17]。寧兆榮等用脂肪干細胞復合載ICA-納米羥基磷灰石支架材料對兔下頜骨缺損進行修復，12周后骨缺損修復良好[18]。本課題的設計基于以上思考，將CPP與ICA按比例混合后制成復合骨支架，CPP/ICA復合骨支架可以優(yōu)勢互補，期待用于骨缺損的修復。但是，該復合材料是否存在其他的化學反應或生化變化，而不能用于動物體內試驗，本實驗對其進行了體外生物相容性試驗。

任何一種修復材料在應用于動物體內試驗之前，首先應評價其生物相容性。只有具備良好生物相容性的骨支架，才能在體內進行試驗。本實驗中，MG63細胞在CPP/ICA復合骨支架上生長良好，呈梭狀生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，出現片狀生長。與CPP/ICA復合骨支架浸提液培養(yǎng)，細胞貼壁良好，細胞形態(tài)飽滿，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數量逐漸增多，與陽性對照組比較，差異有顯著性，且細胞毒性等級為0，證實CPP/ICA復合骨支架具有良好的生物相容性，可用于動物體內試驗，具有良好的使用前景。