前列腺特異性膜抗原在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義

劉傳新，王海龍，吳秀瓊，劉斐燁

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州 510315；2.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300120)

最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，肺癌在癌癥相關(guān)死亡中仍占第一位[1]，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)可能為研究新的治療方案提供方向。前列腺特異性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen，PSMA)是一種定位于11p11-p12的II型跨膜糖蛋白[2]，正常情況下，在前列腺、腎臟、小腸、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和唾液腺均有低水平表達(dá)[3]。PSMA在大部分前列腺癌細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)，且與腫瘤分期和病理分級(jí)有關(guān)[4]。近年來(lái)有研究顯示，PET/CT在甲狀腺癌、腎癌、胃腸間質(zhì)細(xì)胞瘤、肝癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等實(shí)體瘤中也能檢測(cè)到PSMA攝取[5]。有文獻(xiàn)提及68GA-PSMA PET/CT能檢測(cè)到肺癌及其轉(zhuǎn)移部位中的PSMA攝取[6-7]，但PSMA在肺癌組織中的表達(dá)及與臨床特征的關(guān)聯(lián)國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。

新生血管是惡性腫瘤的一個(gè)重要標(biāo)志，抗血管靶向治療作為一種新的靶向治療方法近年來(lái)越來(lái)越受關(guān)注。有研究顯示，PSMA在胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞(Neovascular Endothelial Cells，NEC)中有表達(dá)[8-10]，提示PSMA可能是一個(gè)有前景的抗腫瘤血管生成治療靶點(diǎn)。PSMA在肺癌組織腫瘤細(xì)胞和NECs中的表達(dá)情況仍不明確。

本研究中，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了PSMA在非小細(xì)胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC)組織中的表達(dá)，并且分析其與年齡、性別、臨床分期、病理類型、原發(fā)灶大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征的關(guān)聯(lián)，初步探討PSMA在NSCLC中的表達(dá)及可能的作用。

1 資料與方法

1.1組織標(biāo)本:本研究共納入南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科2013年1月～2018年1月間行外科手術(shù)切除的159例NSCLC組織及42例對(duì)照癌旁肺組織標(biāo)本，均由病理確診，其中包括鱗癌57例，腺癌55例，大細(xì)胞癌47例。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè):PSMA鼠抗人抗體、CD31鼠抗人抗體購(gòu)自Abcam公司或Proteintech公司，羊抗鼠HRP-IgG抗體、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后脫水、浸蠟、包埋后切成4μm厚的切片，隨后進(jìn)行烤片、脫蠟。梯度酒精水化后，加檸檬酸抗原修復(fù)液在120℃下抗原修復(fù)。隨后在H2O2中孵育10 min，PBS沖洗3次，5 min/次。加入PSMA單克隆抗體或CD31單克隆抗體，4℃過(guò)夜后PBS沖洗3次，室溫下加入羊抗鼠HRP-IgG抗體孵育40 min后，PBS沖洗3次，滴加新鮮配制的DAB顯色試劑。顯色3～5 min后，自來(lái)水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染。酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

以CD31作為參照確認(rèn)PSMA在NECs中的表達(dá)。PSMA陽(yáng)性的前列腺癌組織標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。對(duì)于PSMA陽(yáng)性的NSCLC組織標(biāo)本，再以另一PSMA單克隆抗體進(jìn)行復(fù)檢，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

免疫組化的結(jié)果判定分為兩種：陰性(免疫組化在細(xì)胞上沒(méi)有任何染色)，陽(yáng)性(任何細(xì)胞上有確定的免疫組化染色，無(wú)論染色的強(qiáng)度如何)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0(SPSS 17.0, Chicago, IL, USA)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。PSMA與年齡、性別、分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和病理類型的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)來(lái)分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

159例NSCLC組織中，111例腫瘤組織的NECs表達(dá)PSMA，陽(yáng)性率為69.81%，87例腫瘤組織的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PSMA，陽(yáng)性率為54.72%，71例呈NECs和腫瘤細(xì)胞雙陽(yáng)性表達(dá)(44.65%)，40例僅在NECs呈表達(dá)陽(yáng)性(25.16%)，16例僅在腫瘤細(xì)胞中呈表達(dá)陽(yáng)性(10.06%)。所有癌旁肺組織的實(shí)質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均未見(jiàn)PSMA表達(dá)。

腫瘤組織NECs的PSMA表達(dá)與臨床分期呈顯著相關(guān)。98例Ⅰ期和Ⅱ期患者中76例NECs表達(dá)PSMA(77.60%)，61例Ⅲ期和Ⅳ期患者中35例表達(dá)PSMA(57.40%)。Ⅰ期和Ⅱ期患者的陽(yáng)性率要明顯高于Ⅲ期和Ⅳ期的患者(P=0.007)。腫瘤細(xì)胞的PSMA表達(dá)與臨床分期未見(jiàn)明顯相關(guān)(表1，P=0.268)。

此外，如表1所示，NSCLC腫瘤細(xì)胞的PSMA表達(dá)與年齡顯著相關(guān)。年齡≥60歲的患者細(xì)胞表達(dá)PSMA的比例明顯多于年齡≥60歲的患者(66.20% vs 45.50% ，P=0.009)。而NECs的PSMA表達(dá)則與年齡無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P=0.113)。無(wú)論是腫瘤細(xì)胞或NECs，PSMA陽(yáng)性率與患者性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)及病理類型均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表1。

表1 PSMA 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)[例(%)]

3 討論

PSMA首次發(fā)現(xiàn)于1987年，在LNCaP前列腺癌細(xì)胞株中獲取[2]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，PSMA在正常前列腺組織中呈低表達(dá)，在前列腺癌中呈高表達(dá)，并隨著正常前列腺細(xì)胞向高級(jí)別前列腺上皮內(nèi)瘤變、前列腺癌進(jìn)展的過(guò)程表達(dá)升高[11]，與Gleason評(píng)分、PSA水平有顯著關(guān)聯(lián)[12]，因此曾被認(rèn)為是前列腺特異性表達(dá)的抗原。而進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提示，PSMA mRNA和蛋白在多種腫瘤中均有表達(dá)，包括胰腺癌、乳腺癌、腎癌等，證明PSMA并不是只在前列腺癌中特異性表達(dá)[13]。Chang等的研究發(fā)現(xiàn)，PSMA mRNA和蛋白在多種其他實(shí)體瘤的NECs上也有表達(dá)[14]。但PSMA并非在所有腫瘤的NECs上都表達(dá)，其在子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的表達(dá)要高于NECs[15]。筆者的研究首次發(fā)現(xiàn)，PSMA蛋白在腫瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率比癌旁肺組織高，提示PSMA在NSCLC中也可能是一個(gè)輔助診斷標(biāo)志，支持Lars Henning Schmidt等人之前的研究[16]結(jié)論。但是，筆者收集的標(biāo)本中PSMA在NSCLC腫瘤細(xì)胞的表達(dá)率(53.46%)要高于前述研究中的6%，可能與實(shí)驗(yàn)抗體不同、選擇人群不同有關(guān)，具體的機(jī)制原因值得進(jìn)一步研究。

PSMA的表達(dá)模式較為特殊，VEGF、endoglin和整合素等常見(jiàn)的血管靶點(diǎn)在正常組織和腫瘤組織的新生血管上均有表達(dá)，而PSMA則特異性表達(dá)于NECs，在正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞鮮有表達(dá)。這種在NECs表達(dá)的特異性可能與腫瘤新生血管的高度異型性相關(guān)。血管生成源自于內(nèi)皮細(xì)胞的激活[17]，NECs上具有可以選擇性激活PSMA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域，但是在正常血管上不具有這種區(qū)域[18]。因此，PSMA更容易在NECs中被激活和特異性表達(dá)[19]。本研究再次證明，PSMA在NSCLC組織的NECs上特異性地表達(dá)，且在腫瘤細(xì)胞本身也有表達(dá)，提示PSMA有可能作為肺癌抗腫瘤新生血管治療的一個(gè)全新靶點(diǎn)，且可以同時(shí)針對(duì)腫瘤細(xì)胞和NECs發(fā)揮作用。

早期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PSMA表達(dá)與腫瘤分期和病理分級(jí)有關(guān)。PSMA mRNA在I期子宮內(nèi)膜癌中較其他分期升高，其表達(dá)降低低提示無(wú)疾病進(jìn)展期更短[15]。膀胱癌中PSMA mRNA與病理分級(jí)呈正相關(guān)，而PSMA mRNA表達(dá)降低也提示更高的2年生存率[20]。本文研究進(jìn)一步顯示，腫瘤NECs中的PSMA表達(dá)是與NSCLC腫瘤分期有關(guān)的因素，早期患者NECs的PSMA陽(yáng)性率要明顯高于晚期患者，這一結(jié)論與軟組織腫瘤及前述NSCLC研究中數(shù)據(jù)類似[16, 21]。引起這一現(xiàn)象的原因可能是由于腫瘤早期快速增殖造成腫瘤內(nèi)部的缺氧[16]或腫瘤早期階段比晚期階段具有更多的新生血管。

此外，NSCLC腫瘤細(xì)胞本身的PSMA表達(dá)陽(yáng)性率與年齡相關(guān)，<60歲的患者陽(yáng)性率要明顯高于≥60歲的患者，可能由于年齡越小細(xì)胞代謝越旺盛，提示PSMA在NSCLC腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng)過(guò)程可能也發(fā)揮一定作用。無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是NECs的PSMA表達(dá)與患者性別、NSCLC的原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及病理分級(jí)均無(wú)明顯的相關(guān)性，其原因有待于今后進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究對(duì)PSMA在NSCLC組織中的表達(dá)和分布進(jìn)行了檢測(cè)和初步分析，發(fā)現(xiàn)PSMA在NSCLC的腫瘤細(xì)胞和NECs中均有表達(dá)，在對(duì)照的癌旁組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中均不表達(dá)，且NECs中的PSMA表達(dá)水平與患者臨床分期顯著相關(guān)，提示PSMA可能是NSCLC的一個(gè)診斷標(biāo)志和血管生成有關(guān)的治療靶點(diǎn)，其具體的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步探索和分析。