17β-雌二醇對N-甲基-N-亞硝脲誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)效應(yīng)

朱春暉,朱若晨,熊業(yè)城,陳 濤,俞小瑞,4*

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,西安 710061;2陜西省牙頜疾病臨床研究中心;3西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科;4西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部環(huán)境與基因相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:xiaoruiy@xjtu.edu.cn)

神經(jīng)退行性疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康和影響生活質(zhì)量的疾病,臨床常見疾病包括:阿爾茨海默癥、視網(wǎng)膜色素變性和老年性黃斑變性等。神經(jīng)退行性疾病共同表現(xiàn)為非典型性蛋白的合成障礙、線粒體功能紊亂以及細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)[1]。視網(wǎng)膜是由胚胎時(shí)期神經(jīng)外胚葉構(gòu)成的視杯發(fā)育分化而來,與大腦的起源相同。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外延,視網(wǎng)膜也被稱為外周腦,因此視網(wǎng)膜也可作為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制與治療的重要突破口[2]。

近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),雌激素在人體中具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要功能[3]。絕經(jīng)婦女的雌激素水平降低,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率明顯增高[4]。雌激素替代療法已經(jīng)成為防治該類疾病的有效手段[5]。當(dāng)前,有關(guān)雌激素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[6]。17β-雌二醇(17β-estradiol,βE2)是體內(nèi)最豐富、最有效的雌激素,本課題組前期在過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞和光損傷誘導(dǎo)的動物兩個(gè)水平,都觀察到βE2對大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用[7,8]。N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)是理想的誘導(dǎo)視網(wǎng)膜退行性變的化學(xué)誘導(dǎo)劑,可特異性誘導(dǎo)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡[9]。然而,βE2對MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用值得我們進(jìn)一步探討。因此,本研究建立MNU誘導(dǎo)SD大鼠視網(wǎng)膜變性模型,探索βE2對感光細(xì)胞凋亡和氧化損傷的影響,為βE2在視網(wǎng)膜退行性疾病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

取35日齡雌性SPF級SD大鼠72只,體質(zhì)量(150±10)g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號:SCXK(陜)2007-001。24只35日齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為對照(control)和MNU組(每組12只)。為進(jìn)一步觀察βE2對MNU誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用,大鼠隨機(jī)分為生理鹽水(saline)-MNU組和βE2-MNU組(每組12只)。上述4組大鼠給藥后1 d各取6只利用TUNEL檢測視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞,給藥后7 d另取6只大鼠利用蘇木精-伊紅(HE)染色和視網(wǎng)膜電圖(ERG)檢測視網(wǎng)膜形態(tài)和功能。最后,為了揭示βE2對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用和抗氧化的關(guān)系,大鼠隨機(jī)分為saline組,βE2組,saline-MNU組和βE2-MNU組(每組6只),各組藥物處理后1 d使用試劑盒檢測視網(wǎng)膜組織丙二醛(MDA)含量、抑制羥自由基能力及總抗氧化能力(T-AOC)。所有大鼠行卵巢摘除術(shù)后2周進(jìn)行如下處理:MNU組經(jīng)腹腔注射45 mg/kg MNU[9];saline組和βE2組分別經(jīng)玻璃體腔注射4 μl saline或βE2(100 μmol/L);saline-MNU組經(jīng)腹腔注射45 mg/kg MNU后立即經(jīng)玻璃體腔注射4 μl生理鹽水;βE2-MNU組經(jīng)腹腔注射45 mg/kg MNU后立即經(jīng)玻璃體腔注射4 μl濃度為100 μmol/L的βE2;未做處理的同天數(shù)大鼠設(shè)置為control。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸塞拉嗪(吉林方正公司);TUNEL試劑盒(武漢博士德公司);水合氯醛、酒精、二甲苯、蘇木素、伊紅(西安試劑廠);βE2、MNU、多聚甲醛(美國,Sigma公司);復(fù)方托吡卡胺滴眼液、鹽酸奧布卡因(日本,參天制藥有限公司);BCA蛋白定量試劑盒、A018羥自由基測定試劑盒、A003-1丙二醛測定試劑盒、A015-1總抗氧化能力測定試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.3 TUNEL技術(shù)檢測視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡

大鼠藥物處理后1 d,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠,取眼球后頸椎脫臼處死。眼球置于4%多聚甲醛中過夜,后經(jīng)酒精梯度脫水,石蠟包埋。使用組織切片機(jī)獲得5 μm厚組織切片,貼片于多聚賴氨酸修飾的載玻片,65 ℃烘箱烤干。參照TUNEL試劑盒說明書,染色前將視網(wǎng)膜組織切片置于60 ℃烘箱中20 min,隨后經(jīng)二甲苯透明和酒精脫蠟。PBS漂洗后滴加20 μg/ml蛋白酶K,37 ℃作用10 min,隨后加入含有3%過氧化氫的甲醇封閉液室溫作用10 min。TdT酶反應(yīng)液作用于組織切片,室溫避光37 ℃反應(yīng)60 min后加入適量Steptativedin-HRP工作液,室溫避光37 ℃反應(yīng)60 min。隨后使用DAB顯色,鏡下觀察,出現(xiàn)理想深度的顯色時(shí),立即使用PBS漂洗3次,蘇木素復(fù)染。2%鹽酸分色,伊紅染數(shù)秒鐘。酒精脫水,石碳酸速過,二甲苯透明后樹脂封片,充分干燥后鏡下觀察TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞被染色為深棕色。

1.4 視網(wǎng)膜組織勻漿的制備及蛋白濃度測定

大鼠藥物處理后1 d,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠,用鑷子將大鼠眼瞼撐開,突出眼球,然后用刀片將角膜橫向劃開,取出的視網(wǎng)膜組織放入高壓處理過的EP管中,迅速將EP管放入液氮中,大鼠隨后經(jīng)頸椎脫臼處死。待所有視網(wǎng)膜組織取材完畢后,秤重,加入預(yù)冷的9倍體積生理鹽水,將組織充分剪碎,研磨,制備10%組織勻漿。隨后,4 ℃離心機(jī)離心,3 000 r/min,離心10 min,吸取上清,進(jìn)一步使用BCA蛋白定量試劑盒檢測視網(wǎng)膜中蛋白含量,為后續(xù)檢測視網(wǎng)膜組織勻漿中MDA、抑制羥自由基能力及T-AOC做準(zhǔn)備。

1.5 MDA的測定

大鼠藥物處理后1 d,取組織勻漿,按照MDA試劑盒說明書進(jìn)行試劑配制和檢測,分光光度儀于532 nm處測定各管OD值,使用說明書提供的公式計(jì)算樣品中MDA含量:MDA(nmol/mg)=(測定管OD值-對照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度÷蛋白含量(mg/ml)。其中,標(biāo)準(zhǔn)管濃度為10 nmol/ml。

1.6 抑制羥自由基能力檢測

大鼠藥物處理后1 d,取組織勻漿,按照羥自由基試劑盒說明書進(jìn)行試劑配制和檢測,分光光度儀于532 nm處測定各管OD值,利用說明書提供的公式計(jì)算組織抑制羥自由基的能力:抑制羥自由基能力(U/ml)=(對照管OD值-測定管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度÷蛋白含量(mg/ml)。其中,標(biāo)準(zhǔn)管濃度為8.824 mmol/L。

1.7 T-AOC的測定

大鼠藥物處理后1 d,取組織勻漿,按照T-AOC試劑盒說明書進(jìn)行試劑配制和檢測,分光光度儀于520 nm處測定各管OD值,并利用說明書提供的公式計(jì)算組織中T-AOC:T-AOC(U/mg)=(測定管OD值-對照管OD值)×(反應(yīng)液總體積/取樣量)÷0.3÷蛋白含量(mg/ml)。

1.8 視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,ERG)檢測視網(wǎng)膜功能

大鼠單次給藥后7 d,大鼠暗適應(yīng)24 h后,將30 μl鹽酸塞拉嗪溶于10%水合氯醛中,配成大鼠ERG專用麻醉劑,按照3.5 ml/kg的劑量麻醉大鼠,并用復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。待大鼠進(jìn)入深麻醉狀態(tài)時(shí),在其眼球表面滴加鹽酸奧布卡因滴眼液,表面麻醉。大鼠平趴于動物平臺上,左側(cè)頰部插入?yún)⒖茧姌O,尾部皮下插入接地電極,記錄電極放置于左眼角膜中央,力度以剛剛接觸角膜為宜。在角膜和電極間滴加一滴生理鹽水,調(diào)節(jié)雙眼阻抗系數(shù)穩(wěn)定小于3%。所有以上操作在微弱紅光下進(jìn)行,測試時(shí)使用強(qiáng)度為0.011 cd*s/m2的單次白色閃光刺激大鼠,閃光刺激間隔1 min,按順序記錄視桿細(xì)胞反應(yīng)(Rod-ERG)和最大混合反應(yīng)(Max-ERG)。

1.9 蘇木素伊紅染色(hematoxylin and eosin staining,HE)觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)

大鼠單次給藥后7 d,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠,取眼球后頸椎脫臼處死。眼球置于4%多聚甲醛中過夜,后經(jīng)酒精梯度脫水,石蠟包埋,使用組織切片機(jī)獲得5 μm厚組織切片,65 ℃烘箱烤干。將載有組織切片的載玻片放入二甲苯脫蠟,隨后置于不同梯度酒精進(jìn)行復(fù)性,蘇木素、伊紅染色,樹脂封片進(jìn)行HE染色,鏡下觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MNU誘導(dǎo)SD大鼠感光細(xì)胞的凋亡

本研究首先使用TUNEL、HE和ERG技術(shù)檢測腹腔注射45 mg/kg MNU對大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的影響。TUNEL結(jié)果顯示,與control組相比,MNU組視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer,ONL)出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞(棕色細(xì)胞);HE結(jié)果顯示,MNU組大鼠視網(wǎng)膜的ONL和內(nèi)核層(inner nuclear layer,INL)與control組相比均出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量的減少,視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂,色素上皮細(xì)胞遷移至原本ONL的位置;ERG結(jié)果顯示,control組Rod-ERG(a波均值74.56±12.77,b波均值189.96±18.8),Max-ERG(a波均值78.37±16.54,b波均值174.00±15.37),而MNU組出現(xiàn)了熄滅型電生理的表現(xiàn),檢測不出來Rod-ERG和Max-ERG的值(見圖1)。本實(shí)驗(yàn)使用MNU在SD大鼠中成功構(gòu)建了感光細(xì)胞凋亡模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供模型基礎(chǔ)。

2.2 βE2保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜免受MNU誘導(dǎo)的損傷

為了觀察βE2是否對MNU誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜損傷具有保護(hù)作用,本研究繼續(xù)使用TUNEL、HE和ERG檢測進(jìn)行評估。TUNEL結(jié)果顯示,與saline-MNU組相比,βE2-MNU組大鼠視網(wǎng)膜ONL中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(棕色細(xì)胞);HE染色結(jié)果顯示saline-MNU組ONL、INL發(fā)生融合,而βE2-MNU組雖然ONL的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定紊亂,但是結(jié)構(gòu)基本完整,ONL、INL的界限還依稀可見;ERG結(jié)果顯示,βE2-MNU組與saline-MNU組相比,Rod-ERG和Max-ERG反應(yīng)a、b波均有明顯的恢復(fù)(見圖2)。

ONL:外核層;INL:內(nèi)核層;GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;Rod-ERG:視桿細(xì)胞反應(yīng)視網(wǎng)膜電圖;Max-ERG:最大混合反應(yīng)視網(wǎng)膜電圖圖2 βE2抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能Figure 2 βE2 inhibits retinal cell apoptosis, and protects retinal structure and its function

2.3 βE2抵抗視網(wǎng)膜的氧化損傷

為了進(jìn)一步揭示βE2對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用是否和抗氧化有關(guān),我們在各組藥物處理后1 d檢測了MDA、抑制羥自由基能力和T-AOC。各組大鼠藥物處理后1 d,與saline組相比,saline-MNU組視網(wǎng)膜組織內(nèi)MDA的含量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與saline-MNU組相比,βE2-MNU組玻璃體腔注射βE2后視網(wǎng)膜中的MDA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

各組大鼠藥物處理后1 d,與saline組相比,saline-MNU組視網(wǎng)膜組織抑制羥自由基的能力顯著減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與saline-MNU組相比,βE2-MNU組視網(wǎng)膜組織抑制羥自由基的能力顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與saline組相比,*P<0.05;與saline-MNU組相比,#P<0.05圖3 大鼠處理后1 d βE2減少視網(wǎng)膜組織中MDA的含量Figure 3 Inhibitory effect of βE2 on MDA content in the retinal tissue at day 1 after treatment

與saline組相比,*P<0.05;與saline-MNU組相比,#P<0.05圖4 大鼠藥物處理后1 d βE2增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織抑制羥自由基能力Figure 4 Effect of βE2 on hydroxyl radicals in the retinal tissue at day 1 after treatment

各組大鼠藥物處理1天后,與saline組相比,saline-MNU組視網(wǎng)膜組織T-AOC的能力顯著減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與saline-MNU組相比,βE2-MNU組視網(wǎng)膜組織T-AOC的能力顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與saline組相比,*P<0.05;與saline-MNU組相比,#P<0.05圖5 大鼠藥物處理后1 d βE2增強(qiáng)視網(wǎng)膜組織T-AOCFigure 5 Effect of βE2 on T-AOC capacity in the retinal tissue at day 1 after treatment

3 討論

視網(wǎng)膜退行性疾病以細(xì)胞凋亡為主要病理特征,然而,由于人類視網(wǎng)膜退行性疾病病因復(fù)雜,臨床缺乏有效的治療手段,因而構(gòu)建視網(wǎng)膜退行性疾病動物模型來研究該類疾病的致病機(jī)制,尋找有效的治療方法,顯得十分重要。MNU作為一種烷化劑,通過使感光細(xì)胞DNA甲基化引發(fā)DNA突變,最終導(dǎo)致感光細(xì)胞凋亡。MNU誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡模型,與視網(wǎng)膜退行性疾病特征類似,且具有一次腹腔給藥、建模時(shí)間短、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、便于操作等優(yōu)點(diǎn)[10]。在本研究中,45 mg/kg的MNU經(jīng)腹腔注射SD大鼠1 d后出現(xiàn)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,7 d后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂、功能下調(diào),成功構(gòu)建了MNU誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡模型,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定良好的模型基礎(chǔ)。

大量的研究表明雌激素具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。本課題組前期在光損傷誘導(dǎo)的感光細(xì)胞凋亡動物模型中,觀察到βE2具有抗凋亡保護(hù)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的作用[7,8]。為了探究βE2是否也能抵抗MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,我們在MNU誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡模型中,通過玻璃體腔注射βE2與注射saline相比,注射βE2后大鼠ERG的a、b波明顯恢復(fù),ONL細(xì)胞丟失明顯改善,感光細(xì)胞的凋亡顯著減少,這些結(jié)果表明βE2具有抑制MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷的作用。MDA的含量常常反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映細(xì)胞損傷的程度。羥基自由基是一種破壞能力極強(qiáng)的氧化劑,DNA受到羥自由基的攻擊后,會發(fā)生堿基的損傷、核酸斷裂等嚴(yán)重的氧化損傷,因此選擇體內(nèi)抑制羥自由基能力作為檢測指標(biāo)。同時(shí),機(jī)體存在多種抗氧化物質(zhì),以便清除體內(nèi)ROS,阻止氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,因此,檢測組織內(nèi)T-AOC具有重要的生物學(xué)意義。為了揭示βE2是否通過抗氧化機(jī)制發(fā)揮其抑制MNU誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷的作用,我們首先檢測了MNU腹腔給藥后視網(wǎng)膜組織中MDA的含量及抗羥自由基能力和T-AOC能力,發(fā)現(xiàn)MNU處理后視網(wǎng)膜組織中MDA的含量顯著上升,而抑制羥自由基能力和T-AOC能力均顯著下降,說明視網(wǎng)膜組織處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。而當(dāng)玻璃體腔注射βE2后可以明顯逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo),表明βE2具有提高視網(wǎng)膜組織抗氧化能力,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),實(shí)現(xiàn)抵抗MNU誘導(dǎo)大鼠感光細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

雌激素發(fā)揮抗氧化作用的分子機(jī)制目前認(rèn)為主要有兩種途徑:①雌激素分子本身具有抗氧化的性質(zhì),這是由于類固醇分子的A環(huán)C3位上存在的羥基,可以直接清除機(jī)體的自由基。研究發(fā)現(xiàn)人工合成雌激素的同型異質(zhì)體ZYC-5,雖然缺乏激活經(jīng)典雌激素受體(estrogen receptor,ER)的活性,卻能通過它的自由基清除功能保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元,對抗N-甲基-D-天冬氨酸誘導(dǎo)的壞死及NMDA受體拮抗劑誘導(dǎo)的壞死和凋亡[11];②雌激素能提高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性,提高自由基清除速率、減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物的堆積,從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。在本研究中,βE2發(fā)揮抗氧化作用的分子機(jī)制可能也存在上述兩種途徑,但這還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

βE2發(fā)揮抗凋亡神經(jīng)保護(hù)作用的信號通路主要通過經(jīng)典的基因組途徑和非基因組途徑。在經(jīng)典基因組途徑中,βE2與靶細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的ER結(jié)合,引起受體構(gòu)象變化,導(dǎo)致二聚化,受體易位至細(xì)胞核與DNA上ER原件結(jié)合,從而定位或靠近靶基因啟動子,啟動下游基因表達(dá)[13]。在βE2介導(dǎo)的非基因組通路中,βE2與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,快速激活多條信號通路,調(diào)控下游蛋白,發(fā)揮抗凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[14]。βE2可同時(shí)啟動基因組和非基因組機(jī)制,完成多種生理功能[15]。本研究中βE2能有效抑制MNU引起的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能損傷,抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡,然而,具體通過經(jīng)典或非經(jīng)典途徑發(fā)揮效用,還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究應(yīng)用MNU誘導(dǎo)SD大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,并以此作為建立研究視網(wǎng)膜退行性疾病的動物模型。通過玻璃體腔注射βE2,觀察βE2在MNU誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡動物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用,初步探討βE2保護(hù)作用的機(jī)制可能與βE2降低MDA含量,抗羥自由基能力和T-AOC的上升有關(guān)。然而,雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制尚需更深入的研究,最終為雌激素在神經(jīng)退行性疾病中的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)與指導(dǎo)。