雌激素通過組胺H1受體調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性的機(jī)制研究

秦 斌,許紹嫻,蔣瀟灑,謝丹紅,許曉毓,戴 菲,董 蕾

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:dong556@126.com)

腸易激綜合征廣泛影響著人類生活質(zhì)量,特別是給女性的工作和生活狀態(tài)帶來(lái)困擾,其重要的病理生理機(jī)制之一為內(nèi)臟高敏感。近年有很多關(guān)于雌激素和腸易激綜合征(IBS)相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn),雌激素可能影響內(nèi)臟敏感性。以往的研究多有關(guān)其經(jīng)典受體ERα和ERβ介導(dǎo)的雌激素效應(yīng)[1],近年也有雌激素通過G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知的研究報(bào)道,這些研究多集中在雌激素通過中樞層面調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性[2]。然而,腸道是IBS發(fā)病和內(nèi)臟敏感性出現(xiàn)重要的一環(huán),雌激素對(duì)腸黏膜功能的直接作用很少被研究。因?yàn)榇萍に厥荏w在消化道的分布研究較少,雌激素、腸黏膜靶點(diǎn)與內(nèi)臟敏感性三者的聯(lián)系尚不清楚。我們前期研究證實(shí),多種雌激素受體在人類腸道黏膜肥大細(xì)胞中表達(dá),并發(fā)現(xiàn)雌激素受體之一GPR30的表達(dá)與內(nèi)臟高敏感相關(guān)癥狀有關(guān),并進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)雌激素受體同樣表達(dá)于大鼠腸道肥大細(xì)胞[3]。肥大細(xì)胞通常釋放組胺、P物質(zhì)等活性產(chǎn)物從而發(fā)揮活性作用,其中組胺H1R是組胺參與免疫和過敏反應(yīng)最主要的結(jié)合位點(diǎn),并且有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)H1R參與IBS發(fā)病過程[4],但雌激素是否通過腸道H1R發(fā)揮作用尚無(wú)研究。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,通過去卵巢大鼠動(dòng)物模型,探討外源性雌激素引起內(nèi)臟肌電活動(dòng)(VMR)改變是否與組胺有關(guān),并進(jìn)一步探討雌激素通過H1R調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

β-雌二醇(Sigma-Aldrich,美國(guó)),DMSO(Sigma-Aldrich,美國(guó))。Fexofenadine(Sigma-Aldrich,美國(guó)),組胺ELISA試劑盒(上海西唐,中國(guó)),大鼠H1R抗體(Santa Cruz,美國(guó))。Power lab記錄分析儀(ADI公司,澳大利亞),生物電放大器(成都生物儀器廠,中國(guó)),凝膠成像分析系統(tǒng)與Western顯像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó))。8F導(dǎo)尿管(B. Braun醫(yī)療公司,馬來(lái)西亞)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雌性SD大鼠,清潔級(jí),體質(zhì)量200-250 g,8周齡,購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào):SYXK(陜)2018-001)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予自來(lái)水和普通動(dòng)物飼料喂養(yǎng)。所有動(dòng)物均行雙側(cè)卵巢切除術(shù),術(shù)后7-10 d實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組(n=6):對(duì)照組給予對(duì)照劑(0.1 ml橄欖油+0.1 ml DMSO腹腔注射)后不采用束縛應(yīng)激;其余三組均在用藥后0.5 h給予束縛應(yīng)激,分別為:給予對(duì)照劑(0.1 ml橄欖油+0.1 ml DMSO腹腔注射);雌二醇組:給予雌二醇(10 μg/kg,溶于0.1 ml橄欖油腹腔注射+0.1 ml DMSO腹腔注射);雌二醇+組胺H1R阻斷劑組,腹腔注射雌二醇(10 μg/kg,溶于0.1 ml橄欖油)+H1R阻斷劑Fexofenadine(20 mg/kg,溶于DMSO)。

1.3 雙側(cè)卵巢切除術(shù)和導(dǎo)絲埋置

8%異戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠,俯臥位固定四肢在板上,背部和頸部備皮后用碘酒充分消毒;腰椎水平沿背部正中線兩側(cè)2-3 cm縱行切開后逐層分離。暴露出粉紅色豌豆大小的卵巢,用鑷子將脂肪組織和卵巢拉出;分別結(jié)扎兩側(cè)輸卵管和血管,將卵巢摘除。醫(yī)用導(dǎo)線(AF-250A)剪成15-20 cm長(zhǎng)度,腹橫肌周圍備皮消毒,行一側(cè)腹部皮膚切口后暴露腹外斜肌;用小圓針將3根(1根備用)電極緊密縫在肌纖維上,電極之間距離0.5 cm;將1根長(zhǎng)塑料導(dǎo)管(10 cm)沿腹部及背側(cè)皮下組織引至頸后外側(cè)皮下,在頸外側(cè)皮膚消毒切開后引出。檢查無(wú)出血后分別縫合腹部和頸部切口。手術(shù)后大鼠均單獨(dú)飼養(yǎng),自由進(jìn)食,恢復(fù)7-10 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 急性束縛應(yīng)激后內(nèi)臟肌電(VMR)檢測(cè)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給藥后30 min行束縛應(yīng)激,用膠帶將大鼠前肩、雙前肢及胸部綁縛到背部,限制大鼠上肢的活動(dòng),但不限制大鼠身體的活動(dòng)和呼吸;將大鼠單獨(dú)放置到籠中,束縛時(shí)間為2 h。束縛應(yīng)激后解除膠帶,30 min后將大鼠放置到筒狀大鼠固定器內(nèi)使大鼠不能活動(dòng)、轉(zhuǎn)身或逃跑;Powerlab電生理記錄儀系統(tǒng)與大鼠頸部裸露電極相連,將帶有球囊的導(dǎo)尿管(8F)插入大鼠距肛門3.5-4 cm處直腸。待大鼠適應(yīng)固定和球囊擴(kuò)張(CRD)后,階梯向球囊內(nèi)注氣,體積分別為0,0.4,0.8,1.2 ml;提高壓力時(shí)需排空氣體并間隔3 min。每個(gè)壓力梯度持續(xù)擴(kuò)張20 s,重復(fù)3次記錄VMR;大鼠VMR使用Chart5.0軟件進(jìn)行測(cè)量計(jì)算,VMR的分析采用擴(kuò)張過程中20 s的曲線下面積(AUC)減去擴(kuò)張前基線期20 s的面積。將對(duì)照組大鼠0.4 ml擴(kuò)張時(shí)AUC設(shè)為參照AUC,VMR求相對(duì)值。

1.5 標(biāo)本采集和組胺檢測(cè)

各組大鼠球囊擴(kuò)張結(jié)束后,腹腔內(nèi)注射過量10%水合氯醛處死動(dòng)物,打開腹腔,用注射器取右心室血,4 ℃下1 500 r/min離心10 min,取上清,-70 ℃保存,用于檢測(cè)血漿組胺含量。其后分離截取大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸,用生理鹽水沖洗后-70 ℃冰箱保存,用于檢測(cè)組織中組胺含量和Western blot檢測(cè)。一塊大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織用冰生理鹽水反復(fù)沖洗剪碎,使用微量電動(dòng)組織勻漿器將組織塊快速研磨制成10%的組織勻漿。血漿和組織中組胺含量測(cè)定參照ELISA試劑盒說(shuō)明書和既往研究分別進(jìn)行[5]。

1.6 Western blot法檢測(cè)腸道H1R受體

參照既往的方法[6],簡(jiǎn)要步驟如下:取實(shí)驗(yàn)大鼠腸道標(biāo)本一塊剪碎加入裂解液,倒出組織勻漿液置于EP管中高速離心5 min提取蛋白。準(zhǔn)備BCA工作液稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品,酶標(biāo)儀計(jì)算待測(cè)樣品的蛋白含量。DS-PAGE凝膠電泳:取出蛋白樣本,冰上溶解,提取計(jì)算好的蛋白樣品與緩沖液在室溫下按照1 ∶5體積比均勻混合,95 ℃煮沸5 min。制膠和灌膠后進(jìn)行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入到5%牛奶封閉后加入H1R一抗，搖床上4 ℃過夜，加入二抗室溫2 h，浸入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑中顯色。按30 s、1 min、3 min、5 min梯度曝光，用掃描儀對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行掃描，用Gel-Pro軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值，作為H1R蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急性束縛應(yīng)激對(duì)去卵巢大鼠VMR的影響

大鼠在直腸擴(kuò)張?bào)w積為0 ml時(shí),VMR表現(xiàn)為平滑的曲線,當(dāng)球囊擴(kuò)張?bào)w積為0.4 ml時(shí),肌電圖變得密集,當(dāng)球囊擴(kuò)張?bào)w積為0.8 ml和1.2 ml時(shí),肌電圖波形變得更加密集,并出現(xiàn)明顯增高和成簇出現(xiàn)的波峰(見圖1)。對(duì)不同球囊擴(kuò)張?bào)w積下兩組大鼠腹壁肌電活動(dòng)(VMR)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),在0 ml和0.4 ml球囊直腸擴(kuò)張時(shí)兩組大鼠腹壁肌電圖曲線下面積無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在球囊擴(kuò)張?bào)w積為0.8 ml和1.2 ml時(shí),應(yīng)激組大鼠VMR明顯高于對(duì)照組(P<0.01,見圖1)。

與control組相比,*P<0.01,**P<0.01圖1 應(yīng)激組與對(duì)照組球囊擴(kuò)張后VMR的比較Figure 1 Comparison of VMR after CRD between stress group and control group

2.2 外源性雌激素對(duì)VMR的影響

與應(yīng)激組相比,雌激素組大鼠在0.4 ml直腸球囊擴(kuò)張時(shí)VMR無(wú)明顯差異,而在0.8 ml(P=0.036)和1.2 ml(P=0.017)球囊擴(kuò)張時(shí)VMR明顯升高(見圖2)。

2.3 阻斷H1R對(duì)外源性雌激素調(diào)節(jié)VMR的影響

給予去卵巢大鼠H1R阻斷劑Fexofenadine(Fex)和雌二醇(estradiol)后檢測(cè)動(dòng)物腹壁肌電活動(dòng),發(fā)現(xiàn):兩組大鼠在0.0 ml和0.4 ml體積直腸球囊擴(kuò)張時(shí)VMR無(wú)明顯差異,而estradiol+Fex組在0.8 ml和1.2 ml體積球囊擴(kuò)張時(shí)VMR明顯低于estradiol組(P<0.01,見圖2)。當(dāng)球囊擴(kuò)張?bào)w積為0.8 ml和1.2 ml時(shí),VMR波形逐漸密集,在1.2 ml時(shí)出現(xiàn)增高和成簇出現(xiàn)的波峰(見圖2)。

圖2 不同組別直腸球囊擴(kuò)張后VMR的比較Figure 2 Comparison of VMR after CRD between different groups

2.4 血漿和腸道組胺的變化

四組大鼠血漿組胺濃度相比無(wú)差異(P=0.53,見表1)。與control相比,stress組腸道組胺含量升高(P=0.04),estradiol+stress組腸道組胺含量明顯高于control組和stress組(P<0.01),H1R阻斷劑Fex組腸道組胺含量明顯高于control組和stress組(P<0.01),而estradiol+stress組和estradiol+Fex+stress組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.34,見表1)。

表1 不同組別血漿和腸道組胺含量的比較

2.5 腸道H1R蛋白的表達(dá)

通過Wesern blot法檢測(cè)H1R在腸道的表達(dá)發(fā)現(xiàn):estradiol+stress組和estradiol+Fex+stress組、control組、stress組大鼠腸道H1R的相對(duì)蛋白含量(H1R/GADPH)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.93,見圖3)。

圖3 不同組別腸道H1R的含量比較Figure 3 Comparison of H1R content in colon among different groups

3 討論

前期的研究發(fā)現(xiàn),在腸道可以檢測(cè)出雌激素多種受體,并且與內(nèi)臟敏感性相關(guān)[3],但是否通過組胺等活性物質(zhì)發(fā)揮作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了雌激素引起VMR升高的同時(shí)腸道組胺也出現(xiàn)了升高,而阻斷組胺H1R時(shí)可以逆轉(zhuǎn)雌激素對(duì)VMR的作用。

大鼠腹壁電生理檢測(cè)即VMR能直接記錄腹壁肌電活動(dòng),從而反映大鼠的內(nèi)臟敏感性,為大鼠內(nèi)臟痛檢測(cè)提供了客觀和可量化的指標(biāo),是目前腸道電生理研究中通用的反映內(nèi)臟敏感性的方法[7]。在本實(shí)驗(yàn)中VMR隨擴(kuò)張球囊壓力升高而增高,檢測(cè)結(jié)果具有可重復(fù)性,說(shuō)明VMR間接地提示了動(dòng)物模型內(nèi)臟敏感狀態(tài)。研究通過結(jié)直腸球囊擴(kuò)張后記錄VMR,發(fā)現(xiàn)急性束縛應(yīng)激大鼠內(nèi)臟敏感性高于未接受應(yīng)激者,說(shuō)明急性束縛應(yīng)激模型可以誘發(fā)內(nèi)臟高敏感狀態(tài),因此本研究采用急性束縛應(yīng)激聯(lián)合直腸球囊擴(kuò)張的方法檢測(cè)大鼠VMR作為動(dòng)物模型。大鼠的雌激素水平因性別而異,雄性大鼠的雌激素來(lái)源于體內(nèi)多個(gè)器官,影響因素較多難以控制其含量,因此本實(shí)驗(yàn)未使用雄性大鼠。而雌性大鼠的雌激素主要來(lái)源于卵巢,但其水平隨著動(dòng)情周期波動(dòng),因此本研究中使用雌性大鼠,在雙側(cè)卵巢切除后給予外源性雌激素,使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間雌二醇水平具有可比性。

去卵巢雌性大鼠在急性束縛應(yīng)激前給予外源性雌激素能明顯增加大鼠內(nèi)臟敏感性,直接說(shuō)明雌激素能影響內(nèi)臟感知,這與以往的研究結(jié)果一致[8]。但以往的研究多發(fā)現(xiàn)雌激素在中樞層面的作用[9,10],而雌激素促使外周腸道釋放活性物質(zhì)少有研究,本研究通過檢測(cè)腸道活性物質(zhì)的改變探討雌激素對(duì)腸道靶點(diǎn)的直接作用。組胺是人和動(dòng)物體內(nèi)重要的化學(xué)遞質(zhì),多數(shù)貯存于肥大細(xì)胞中,當(dāng)機(jī)體受到某種刺激引起肥大細(xì)胞膜通透性增加便會(huì)釋放組胺等活性物質(zhì)。因此本研究選擇腸道組胺水平來(lái)反映肥大細(xì)胞脫顆粒的狀態(tài)。但組胺存在于消化道、呼吸道、皮膚等多個(gè)部位,因此研究中同時(shí)檢測(cè)了血漿組胺水平,以免腸道外來(lái)源的組胺影響結(jié)論的推斷。研究中檢測(cè)到雌二醇干預(yù)后VMR的增高伴隨著腸道組胺含量的增加,而血漿組胺水平并無(wú)改變,提示腸道可能是雌激素調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺的靶點(diǎn)之一,且雌二醇的作用與腸道組胺等活性物質(zhì)的改變有關(guān),而大鼠血漿組胺無(wú)明顯改變提示雌激素作用的靶點(diǎn)可能為腸道肥大細(xì)胞而非中樞位點(diǎn)。腸道存在多種活性物質(zhì),包括五羥色胺、P物質(zhì)、血管活性腸肽等,本研究?jī)H證實(shí)了腸道組胺水平的變化,并未排除其他活性物質(zhì)潛在的作用,不能除外多種活性物質(zhì)協(xié)同作用調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性。

組胺影響腸道功能的作用不但與組胺的含量有關(guān),還可能與組胺受體的水平和活性相關(guān),而組胺受體亞型有四種,其中組胺1型受體H1R是其參與免疫和超敏反應(yīng)最主要的結(jié)合位點(diǎn)[11],既往研究發(fā)現(xiàn)H1R參與IBS內(nèi)臟高敏感發(fā)病過程[4,12]。通過使用組胺H1R阻斷劑Fexofenadine(Fex)阻斷組胺H1信號(hào),證實(shí)Fex聯(lián)合雌激素降低了雌激素對(duì)內(nèi)臟敏感性的影響。研究還發(fā)現(xiàn)Fex對(duì)大鼠血漿和結(jié)腸的組胺水平均無(wú)影響,說(shuō)明H1R阻斷劑起作用依賴的是阻斷H1信號(hào),而不是影響組胺的釋放,同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明組胺是雌激素調(diào)節(jié)內(nèi)臟感知的中間介質(zhì)之一。研究還檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道H1R的含量,發(fā)現(xiàn)在4個(gè)不同的組別中,雖然各組大鼠內(nèi)臟敏感性不同,但H1R的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示影響內(nèi)臟敏感性高低的是腸道組胺的含量,而不是H1R的含量水平。本研究的另一局限性在于僅研究了組胺受體一種亞型的作用,無(wú)法完全排除組胺其他亞型的影響。并且雖然證實(shí)了組胺通過腸道受體H1R調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性,但因?yàn)閯?dòng)物模型中未阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)下傳的通路,因此不能完全排除中樞層面的影響。

綜上所述,本研究證實(shí)雌激素調(diào)節(jié)大鼠內(nèi)臟敏感性的作用與腸道組胺的含量有關(guān),外源性雌激素可以增加腸道組胺含量而增加內(nèi)臟敏感性,在H1R阻斷劑抑制組胺的作用后,雌激素對(duì)內(nèi)臟敏感性的增強(qiáng)效應(yīng)減低,而具體的信號(hào)通路尚需進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究闡明。