上皮性卵巢惡性腫瘤中SFRP1的表達(dá)及與β-catenin的相關(guān)性

顧中亮,尉春艷

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

上皮性卵巢惡性腫瘤在女性生殖系統(tǒng)腫瘤里發(fā)病率雖居第3位,其死亡率卻居于首位,且5年生存率小于50%,嚴(yán)重威脅女性健康[1,2]。研究表明,分泌型卷曲蛋白1(secretory crimp protein,SFRP1)作為分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族(secreted frizzled-related proteins family,SFRPs)的一員,由定位于后者8q12-11.1位點(diǎn)的基因編碼[3]。SFRP1作為Wnt的一種特異性拮抗劑可直接作用于Wnt蛋白,從而發(fā)揮負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用[4,5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)大部分動(dòng)物的細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,近年來(lái)較多研究發(fā)現(xiàn)其異常激活與大部分腫瘤如宮頸癌、直腸癌、乳腺癌、胰腺癌等均存在顯著相關(guān)性[6]。由于目前SFRP1也被定義為一種新的抑癌基因,其異常表達(dá)可能干擾Wnt信號(hào)通路進(jìn)而參與某些腫瘤的發(fā)生或轉(zhuǎn)移[5],但是,其在上皮性卵巢惡性腫瘤的病理發(fā)展過(guò)程中是否也是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而參與其中尚未清楚,因此本研究試圖探究其作用機(jī)制并報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年9月至2018年12月于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的85例上皮性卵巢惡性腫瘤患者作為研究對(duì)象,年齡為25-58歲。所有患者均接受手術(shù)治療并經(jīng)病理確診(漿液性癌38例,黏液性癌24例,透明細(xì)胞癌7例,子宮內(nèi)膜樣癌16例),且均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療;所有患者均未合并其他原發(fā)性腫瘤。患者按(FIGO,2000)標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行手術(shù)-病理分期,其中Ⅰ期34例,Ⅱ期32例,Ⅲ期10例,Ⅳ期9例;按病理學(xué)進(jìn)行分組,其中G1高分化組37例,G2中分化組30例,G3低分化組18例;按是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組,其中淋巴轉(zhuǎn)移組28例,非淋巴轉(zhuǎn)移組57例。本研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)審批。

1.2 材料與方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)SFRP1表達(dá)情況 按照說(shuō)明書,采用免疫組化(SP)法觀察SFRP1陽(yáng)性反應(yīng)情況。試劑由北京雷根生物技術(shù)有限公司提供。由病理科醫(yī)師,光學(xué)顯微鏡下連續(xù)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,記錄細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)棕黃色染色的SFRP1陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù),隨后計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量(5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)÷5×100%)。平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量≤2%為陰性,>2%為陽(yáng)性[3]。比較不同手術(shù)-病理分期、病理學(xué)分組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況時(shí)SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率(計(jì)算公式為SFRP1表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)÷總例數(shù)×100%)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)情況 組織經(jīng)破碎后,蛋白裂解液提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,遵循說(shuō)明書步驟執(zhí)行等體積稀釋,4 ℃冰浴下SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移、洗脫、封板、孵育、洗滌,ECL化學(xué)發(fā)光,顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為參照進(jìn)行讀數(shù)。兔β-catenin一抗及二抗由北京雷根生物技術(shù)有限公司提供。采用ImageJ檢測(cè)蛋白表達(dá)量并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 上皮性卵巢惡性腫瘤組織SFRP1免疫組化染色

免疫組化染色后,鏡下可見(jiàn)SFRP1陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色,但較正常卵巢組織染色程度輕(見(jiàn)圖1)。

2.2 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1的表達(dá)陽(yáng)性率比較

手術(shù)-病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中Ⅰ期的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。不同病理學(xué)分級(jí)患者的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組患者的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 不同臨床特征上皮性卵巢惡性腫瘤患者的SFRP1表達(dá)

2.3 上皮性卵巢惡性腫瘤β-catenin蛋白表達(dá)的比較

不同手術(shù)-病理分期上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量不同(P<0.05),從Ⅰ-Ⅳ期β-catenin相對(duì)表達(dá)量逐漸增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同病理學(xué)分組上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上皮性卵巢惡性腫瘤伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí),β-catenin相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表2)。

A.上皮性卵巢惡性腫瘤組織 B.正常卵巢組織陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D1 上皮性卵巢惡性腫瘤組織SFRP1免疫組化染色情況 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of SFRP1 in epithelial ovarian malignant tumor (×400)

表2 上皮性卵巢惡性腫瘤β-catenin表達(dá)情況

2.4 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量與β-catenin的相關(guān)性

由Pearson分析可見(jiàn),上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量與β-catenin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.757,P<0.001,見(jiàn)圖2)。

圖2 上皮性卵巢惡性腫瘤SFRP1平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量與β-catenin的相關(guān)性Figure 2 Correlation between the percentage of SFRP1 positive cells and β-catenin in epithelial ovarian malignant tumors

3 討論

由于SFRPs在腫瘤染色體中頻繁出現(xiàn)某等位基因的表達(dá)缺失[8],因此被廣泛關(guān)注,而SFRP1作為其中一員,在抑制腫瘤的發(fā)生中也具有重要作用[9]。既往有研究發(fā)現(xiàn),SFRP1參與了卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展,且在高淋巴轉(zhuǎn)移能力的卵巢癌中表達(dá)減少[10],但其在上皮性卵巢惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制尚未完全明確。通過(guò)對(duì)上皮性卵巢惡性腫瘤確診患者腫瘤組織的研究,我們發(fā)現(xiàn),上皮性卵巢惡性腫瘤在手術(shù)-病理分期Ⅲ期、Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí),SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低,這與張孝艷等[11]及曹麗雯等[5]在宮頸癌中的研究結(jié)果相近。其中張孝艷等[11]在對(duì)比正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌組織的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性情況后,即發(fā)現(xiàn)三者的表達(dá)陽(yáng)性率依次降低,且伴隨宮頸癌手術(shù)-病理分期升高逐漸下降并以Ⅳ期最低;但不同之處在于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)轉(zhuǎn)移者。在針對(duì)其他系統(tǒng)腫瘤的研究中,也發(fā)現(xiàn)與本研究類似的SFRP1陽(yáng)性表達(dá)情況,如王建等[12]在對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織的檢測(cè)中即發(fā)現(xiàn),癌癥手術(shù)-病理分期越高,SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率越低,伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)的表達(dá)陽(yáng)性率也低于未轉(zhuǎn)移者;Buim等[13]也發(fā)現(xiàn),在侵襲性膀胱癌中,腫瘤手術(shù)-病理分期越高,SFRP1表達(dá)陽(yáng)性率越低。然而,也有研究發(fā)現(xiàn),在某些腫瘤中,SFRP1表達(dá)情況與上述不同。如Sanini等[14]發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌中,SFRP1存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象;Hoei-Hansen等[15]發(fā)現(xiàn),在睪丸原位癌中,SFRP1較正常睪丸組織也呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá);另外,Joesting等[16]也發(fā)現(xiàn),前列腺腫瘤較正常成人前列腺,其SFRP1表達(dá)也顯著增高;而Lin等[17]發(fā)現(xiàn),在慢性應(yīng)激所致肝細(xì)胞癌中,SFRP1表達(dá)也呈增高趨勢(shì)。分析在不同疾病中SFRP1表達(dá)情況不同的原因,可能是因?yàn)樵诓煌鞴俳M織里SFRP1參與腫瘤發(fā)展所關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路不同所致,也可能因?yàn)樵诓煌M織中SFRP1基因表達(dá)下調(diào)分別為缺失或甲基化等不同原因所致[8,18,19]。

有研究表明,多種腫瘤及其臨床分型、分化程度及侵襲性均與SFRP1異常降低相關(guān)[20-22],而該作用主要通過(guò)SFRP1對(duì)Wnt信號(hào)通路調(diào)控實(shí)現(xiàn)[23-25]。Wnt蛋白是一種分泌性糖蛋白家族,參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)的調(diào)控,而Wnt/β-catenin是其主要信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控異常已被證實(shí)在多種腫瘤如肝癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、胃癌等中有重要作用[6,26-30],且有研究表明該信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[31-34],而SFRPs作為Wnt的特異性拮抗劑之一,是否通過(guò)Wnt/β-catenin通路在上皮性卵巢惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用,尚不清楚。我們通過(guò)對(duì)不同手術(shù)-病理分期、不同病理學(xué)分級(jí)和淋巴轉(zhuǎn)移情況上皮性卵巢惡性腫瘤中β-catenin的檢測(cè),發(fā)現(xiàn):從手術(shù)-病理分期Ⅰ期至Ⅳ期β-catenin相對(duì)表達(dá)量逐漸增高,而上皮性卵巢惡性腫瘤伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)的β-catenin相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,上述情況均與SFRP1陽(yáng)性表達(dá)情況趨勢(shì)相反;而不同病理學(xué)分級(jí)上皮性卵巢惡性腫瘤的β-catenin相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,此特征也與SFRP1陽(yáng)性表達(dá)情況相似。通過(guò)進(jìn)一步分析SFRP1平均陽(yáng)性細(xì)胞百分含量與β-catenin表達(dá)的關(guān)系,可見(jiàn)兩者呈強(qiáng)負(fù)相關(guān),提示SFRP1可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而于上皮性卵巢惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用。分析其機(jī)制,上皮性卵巢惡性腫瘤時(shí),Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活且調(diào)節(jié)異常[31,34],SFRP1高表達(dá)時(shí)可抑制該通路,改善腫瘤的臨床分級(jí)及侵襲性;但是,SFRP1并非僅發(fā)揮拮抗劑的作用,還具有雙向性,即高表達(dá)時(shí)可拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)通路,但低表達(dá)時(shí)可激活Wnt/β-catenin通路進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤臨床分級(jí)增加、侵襲性增加[23,35,36]。然而,不同病理學(xué)分級(jí)上皮性卵巢惡性腫瘤的SFRP1陽(yáng)性表達(dá)情況及β-catenin表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其原因仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

綜上所述,上皮性卵巢惡性腫瘤中SFRP1與β-catenin表達(dá)存在著顯著負(fù)相關(guān)性,SFRP1可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與上皮性卵巢惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,值得關(guān)注。