柱前衍生-毛細管電泳法分離測定苦蕎殼中的8種黃酮類化合物

(六盤水師范學院 化學與材料工程學院，六盤水 553004)

苦蕎學名韃靼蕎麥，別名蕎葉七、野蘭蕎、萬年蕎，屬蓼科，被譽為“五谷之王”[1-5]?？嗍w內含人體所需的多種微量元素[6-7]、氨基酸[8-9]、黃酮類化合物[10-11]等營養(yǎng)成分，具有降低血脂和膽固醇的作用，其中的蘆丁[13]等黃酮類化合物具有抑菌、抗病毒、抗氧化和增強免疫力等作用?？嗍w殼是苦蕎生產過程中的副產物，常作為廢棄物丟棄，不僅造成了資源的浪費還會污染環(huán)境?？嗍w殼由于富含黃酮類化合物，對其中的黃酮類化合物進行的定性和定量分析工作，對于開發(fā)苦蕎殼的經(jīng)濟價值具有重要的指導意義。

目前，黃酮類化合物最常用的分析方法是高效液相色譜法[14]，此方法存在溶劑消耗量大、分析時間長、色譜柱價格昂貴等缺點。毛細管電泳法作為一種快速高效的新型液相分析技術[15-18]，在黃酮類化合物的分離分析方面有較好的應用前景[19-22]。

本工作以雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)為柱前衍生劑對黃酮類化合物進行衍生，采用毛細管電泳對黃酮類化合物衍生物進行分離和測定，以期為苦蕎殼中黃酮類化合物藥物和保健品的開發(fā)提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

HP-3D 型毛細管電泳儀，配二極管陣列檢測器。

8種黃酮類化合物單標準儲備溶液:稱取適量8種黃酮類化合物標準品，用乙腈溶解并定容，配制成2.0×10－4mol·L－1單標準儲備溶液，其他所用質量濃度均由該溶液用乙腈稀釋制得。

衍生劑溶液:2.0×10－4mol·L－1，在安培瓶中加入0.052 mg BSTFA，用乙腈溶解并定容至2.0 mL，密封備用。

兒茶素(Cat)、蘆丁(Rut)、山奈酚(Kae)、槲皮素(Mel)、金絲桃苷(Hyp)、異槲皮苷(Hir)、楊梅素(Myi)、槲皮苷(Que)等8 種標準品的純度均大于98%，衍生劑BSTFA 的純度為96%;乙腈為光譜純;所用試劑均為分析純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

DB-624毛細管柱(50 cm×75μm，5μm)，柱溫25 ℃;工作電壓18 k V;分析波長為254 nm;運行緩沖溶液為15 mmol·L－1硼酸鹽緩沖溶液[p H 9.3，內含15 mmol·L－1β-環(huán)狀糊精(β-CD)];每次進樣前，需分別用0.1 mol·L－1NaOH 溶液、水、運行緩沖溶液沖洗毛細管柱3 min，更換緩沖溶液時，需分別沖洗7 min。

1.3 試驗方法

按照文獻[23]對樣品進行預處理，稱取約1 g苦蕎殼，加入80%(體積分數(shù))乙醇溶液5 mL，在70 ℃攪拌提取2 h，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾，濾液用80%乙醇溶液定容至25.0 mL，在80 ℃水浴中滅酶30 min，冷卻，分取10 mL樣品溶液，加入40 mL衍生劑溶液，于80 ℃水浴中反應30 min，按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗方法對8種黃酮類化合物混合標準溶液進行衍生并測定，其電泳譜圖見圖1。

圖1 8種黃酮類化合物衍生物的電泳譜圖Fig.1 Electropherogram of derivatives of the 8 flavonoid compounds

2.2 分離條件的優(yōu)化

硼酸鹽緩沖溶液是毛細管電泳中常用的緩沖溶液體系，是毛細管電泳分析過程中進行調控分離的重要介質，其濃度會直接影響目標物的分離效率;β-CD 是一種常用于毛細管電泳分離的有機添加劑[24]，對提高分離效率有重要作用。試驗考察了運行緩沖溶液中硼酸鹽的濃度(5，10，15，20，25 mmol·L－1)對8種黃酮類化合物分離效果的影響，結果見圖2。

圖2 硼酸鹽緩沖溶液的濃度對8種黃酮類化合物遷移時間和分離度的影響Fig.2 Effect of concentration of borate buffer solution on migration time and resolution of the 8 flavonoid compounds

由圖2 可以看出:當硼酸鹽緩沖溶液濃度為5 mmol·L－1時，遷移時間較短，但分離度較差;隨著硼酸鹽緩沖溶液濃度的增加，遷移時間和分離度都隨之增加;當硼酸鹽緩沖溶液濃度為15 mmol·L－1時，遷移時間適中，分離度較大。試驗選擇硼酸鹽緩沖溶液的濃度為15 mmol·L－1。試驗還對15 mmol·L－1的硼酸鹽緩沖溶液的酸度(pH 8.9～9.3)進行了優(yōu)化，結果顯示:硼酸鹽緩沖溶液的p H由8.9增至9.3時，黃酮類化合物的分離度隨之增加;當pH 為9.4時，基線漂移嚴重，推測是OH－濃度較大，導致離子強度增大，電流強度明顯增大所致。綜合考慮，試驗選擇硼酸鹽緩沖溶液的p H 為9.3。

試驗還考察了硼酸鹽緩沖溶液中β-CD 的濃度(5，10，15，20，25 mmol·L－1)對8種黃酮類化合物衍生物分離效果的影響，結果見圖3。

由圖3可以看出:當運行緩沖溶液中β-CD 濃度為15 mmol·L－1時，遷移時間適中，分離度最高。因此，試驗選擇運行緩沖溶液中β-CD 的濃度為15 mmol·L－1。

2.3 標準曲線和檢出限

按照試驗方法對8種黃酮類化合物混合標準溶液系列進行衍生化和測定，以8種黃酮類化合物衍生物的濃度為橫坐標，其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)，8種黃酮類化合物衍生物的檢出限見表1。

由表1可以看出，8種黃酮類化合物衍生物的檢出限為0.022～0.039 mmol·L－1。

2.4 精密度和回收試驗

按照試驗方法對苦蕎殼樣品進行2個濃度水平的加標回收試驗，每個濃度水平平行測定5次，計算測定值的相對標準偏差(RSD)和回收率，結果見表2。

由表2可知:8種黃酮類化合物測定值的RSD為1.3%～3.2%，回收率為99.1%～101%。

苦蕎殼樣品中黃酮類化合物衍生物的電泳譜圖見圖4。

圖3 運行緩沖溶液中β-CD濃度對8種黃酮類化合物遷移時間和分離度的影響Fig.3 Effect of concentration ofβ-CD in running buffer solution on migration time and resolution of 8 flavonoid compounds

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

表2 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

圖4 苦蕎殼樣品中黃酮類化合物衍生物的電泳譜圖Fig.4 Electropherogram of derivatives of the flavonoid compounds in tartary buckwheat shell sample

由圖4可以看出，苦蕎殼樣品中檢出了兒茶素、蘆丁、山奈酚、槲皮素、異槲皮苷，其質量分數(shù)為3.35～5.19 mg·kg－1。

本工作以毛細管電泳分離和測定了苦蕎殼中的黃酮類化合物，該方法有較高的精密度和回收率，對發(fā)掘苦蕎殼潛在的經(jīng)濟價值提供了一定的參考，可為提升苦蕎附加值和拓寬苦蕎產業(yè)鏈服務。