ICP患者血清疏水性膽汁酸與miR-18a水平的相關(guān)性研究

利榮喬，陳 暉，藍(lán)欲裕，姚人業(yè)

1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣西南寧 530000

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠期一種重要的并發(fā)癥，其可致孕婦皮膚瘙癢、黃疸、早產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)，致胎兒宮內(nèi)窘迫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧損傷，該疾病導(dǎo)致圍生兒發(fā)病率和病死率增加。研究表明，疏水性膽汁酸在ICP發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。此外，雌激素受體α(ERα)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受miR-18a的負(fù)性調(diào)控[3]，提示miR-18a可能通過調(diào)控ERα的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膽汁酸，特別是疏水性膽汁酸的體內(nèi)淤積，在ICP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討ICP患者血清miR-18a水平與血清硫水性膽汁酸的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取2017年12月至2019年3月廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院確診的120例輕度、中度、重度ICP患者各40例及同期健康孕婦40例，孕婦年齡為22～34歲，平均(28±4)歲；孕周為28～37周，平均(32.0±4.3)周。4組孕婦一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；單胎妊娠；妊娠前檢查未見瘙癢，妊娠期出現(xiàn)瘙癢，且瘙癢只與妊娠有關(guān)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝炎患者、嚴(yán)重妊娠期合并癥或并發(fā)癥者及其他不適合參加本次研究者。

1.2ICP患者分度診斷標(biāo)準(zhǔn) 輕度ICP：總膽汁酸(TBA)≥10～<40 μmol/L，總膽紅素(TBIL)<20 μmol/L；中度ICP：TBA≥40～<80 μmol/L，TBIL≥20～<40 μmol/L；重度ICP：TBA≥80 μmol/L，TBIL≥40 μmol/L[4-5]。

1.3儀器與試劑 RNAiso Blood(貨號：9112)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：RR037)及TB Green Premix Taq(貨號：RR820)擴(kuò)增試劑均購自Takara公司，has-miR18a及U6逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增引物由上海生工合成。熒光定量PCR儀為Agilent AriaMx。 has-miR18a引物：上游：5′-GGG GTG TTC TAA GGT GCA TCT A-3′；下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；U6引物：上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.4方法 孕婦入院接受腹部超聲檢查，明確孕期；清晨安靜空腹?fàn)顟B(tài)下抽取外周血標(biāo)本5 mL，妥善保存后送檢實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理及檢測。標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)化前處理后采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)，甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和石膽酸(LCA)水平，色譜條件：pH 1～12柱100 μm×23 μm，預(yù)柱為Luna C18(2) 3 μm (10 mm×2 mm)柱，流速：0.20 mL/min，柱溫：35 ℃，流動相:甲酸氨水溶液體積比為1∶200，乙酸水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH=4.5)∶甲醇為30∶70；質(zhì)譜條件：ESI選擇性正離子檢測，SIM方式檢測。工作參數(shù)：干燥氮?dú)鉁囟?00 ℃，霧化器流量1.5 L/min，檢測電壓1.40 kV。

2 結(jié) 果

2.1各組孕婦血清中miR-18a水平比較 與健康對照組比較，輕度、中度和重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與輕度ICP組比較，中度和重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中度ICP組比較，重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組孕婦血清中miR-18a水平

2.2各組孕婦血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平比較 與健康對照組比較，輕度、中度和重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與輕度ICP組比較，中度和重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中度ICP組比較，重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組孕婦血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平

2.3各組孕婦血清miR-18a與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相關(guān)性分析 健康對照組孕婦血清miR-18a水平與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均不相關(guān)(P>0.05)；輕度、中度及重度ICP組孕婦血清miR-18a水平與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.847～-0.531,P<0.05)。見表3。

表3 各組孕婦血清miR-18a與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相關(guān)性分析

3 討 論

ICP多發(fā)生于妊娠中晚期，屬可逆性膽汁淤積癥，ICP 的病因是多因素的，遺傳易感性、激素和環(huán)境因素在其發(fā)病機(jī)制中相互作用。其臨床特點(diǎn)是妊娠30周后開始出現(xiàn)輕微或者嚴(yán)重瘙癢癥狀，通常在分娩后 48 h 癥狀緩解。除了難治性瘙癢和產(chǎn)后出血，孕產(chǎn)婦的預(yù)后通常是良好的。但I(xiàn)CP與胎兒發(fā)病率和病死率密切有關(guān)，特別是早產(chǎn)、胎兒窘迫和突然的不可預(yù)測的胎兒宮內(nèi)死亡。

ICP 與TBA水平升高有關(guān)。本研究表明，疏水性膽汁酸與ICP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。膽汁酸分子內(nèi)既含有親水性的羥基及羧基，又含有疏水性烴核和甲基。親水基團(tuán)均為α型，而甲基為β型，兩類不同性質(zhì)的基團(tuán)位于環(huán)戊烷多氫菲核的兩側(cè)，這種構(gòu)型使得膽汁酸有疏水性和親水性兩種性質(zhì)。疏水性膽汁酸包括膽酸(CA)、DCA、CDCA、GCDCA和LCA，其疏水性的大小順序依次為LCA>GCDCA>DCA>CDCA>CA。疏水性膽汁酸能破壞細(xì)胞基底外膜、細(xì)胞器膜并特異性破壞微管膜的外層，對機(jī)體危害較大[6-7]。疏水性膽汁酸損傷細(xì)胞的機(jī)制與以下機(jī)制有關(guān)：(1)作為炎癥刺激劑活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，直接刺激促炎介質(zhì)的產(chǎn)生；(2)引起線粒體機(jī)能障礙，導(dǎo)致過量活性氧的產(chǎn)生和內(nèi)膜通透性的改變；(3)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞損傷[8-10]。

ICP多發(fā)生于妊娠晚期、多胎妊娠、既往有口服高雌激素水平避孕藥的女性，此類人群雌激素均處于高水平狀態(tài)，提示ICP發(fā)生與雌激素有關(guān)[11]。ICP在多胎孕婦中的患病率是單胎孕婦的5倍，這與更高水平的雌激素是相關(guān)的。ICP與其他類型膽汁淤積相似，在使用過含雌激素劑量大的避孕藥的女性中發(fā)生率較高。有研究證明，雌激素能夠抑制血糖利用，促進(jìn)脂肪分解，釋放游離脂肪酸，而高水平游離脂肪酸誘發(fā)肝臟損傷，進(jìn)而加重膽汁淤積。當(dāng)機(jī)體內(nèi)部雌激素代謝產(chǎn)物增加時(shí)可導(dǎo)致膽汁排泄受阻，從而影響肝臟對硫酸鹽的代謝及排泄，表明高水平的雌激素可能通過受損硫酸鹽化作用和膽汁酸運(yùn)輸誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積。ERα在人體內(nèi)廣泛分布，與其他亞型受體互補(bǔ)共存，共同介導(dǎo)雌激素在靶器官中發(fā)揮效應(yīng)。而在胚胎著床、胎盤發(fā)育等妊娠生理過程中，ERα更是起到重要生理介導(dǎo)作用。研究表明，ERα的異常表達(dá)可能與病理妊娠相關(guān)[12-13]。miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合后調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞生理過程，既往研究表明，ERα在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受miR-18a的負(fù)性調(diào)控[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，各ICP組血清疏水性LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平明顯高于健康對照組，且隨病情加重，LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平越高；各ICP組血清miR-18a明顯下調(diào)，且隨病情加重，miR-18a水平越低。ICP組血清miR-18a水平與疏水性膽汁酸水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.847～-0.531;P<0.05)。因miR-18a可負(fù)性調(diào)控ERα，筆者推測，血清miR-18a水平下調(diào)的孕婦，其組織ERα水平上調(diào)，致其對雌激素的敏感性升高，進(jìn)而導(dǎo)致疏水性膽汁酸在體內(nèi)積聚，對胎兒造成危害，同時(shí)亦損傷孕婦肝細(xì)胞，形成惡性循環(huán)。ICP的診斷需要排除其他膽汁淤積和肝臟疾病，miR-18a有望成為ICP診斷的新血清學(xué)標(biāo)志物，也有望成為鑒別診斷ICP 的新依據(jù)，值得進(jìn)一步深入研究。