西安某醫(yī)院臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌的臨床分布及毒力基因檢測(cè)*

井發(fā)紅，辛 娜，何天嬌，李 卓

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710077

嗜麥芽窄食單胞菌是一種革蘭陰性非發(fā)酵菌，在自然界廣泛分布，亦可寄居于人的呼吸道和腸道中，該菌并非強(qiáng)毒力細(xì)菌。但是，目前它所造成的醫(yī)院內(nèi)感染正在不斷增加。中國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示，在非發(fā)酵菌中嗜麥芽窄食單胞菌分離率位列第3位[1]。目前發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽窄食單胞菌主要感染惡性腫瘤[2]、進(jìn)行了介入性治療[3]、有慢性呼吸道疾病、免疫缺陷、抗菌藥物用藥史[4]、長(zhǎng)期在重癥監(jiān)護(hù)室進(jìn)行治療[5]的患者。而且嗜麥芽窄食單胞菌對(duì)大多數(shù)臨床常用的抗菌藥物天然耐藥，如氨基糖苷類和很多β-內(nèi)酰胺類(如碳青霉烯類)抗菌藥物，導(dǎo)致臨床感染難以控制[6]。本研究對(duì)臨床分離的嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥情況、生物膜形成能力和毒力基因等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合患者臨床信息進(jìn)行分析，旨在了解嗜麥芽窄食單胞菌的耐藥機(jī)制和感染特點(diǎn)，以指導(dǎo)臨床的合理用藥和控制醫(yī)院內(nèi)感染?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2017年1月至2018年12月西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室分離的嗜麥芽窄食單胞菌菌株79株，均來(lái)自住院成人患者，剔除重復(fù)菌株，所有菌株均經(jīng)過(guò)VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀進(jìn)行鑒定，同時(shí)收集患者的臨床信息及抗菌藥物的使用情況。

1.2抗菌藥物及培養(yǎng)基 抗菌藥物包括左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑和米諾環(huán)素，藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，血瓊脂平板和水解酪蛋白瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖公司，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞ATCC27853和大腸埃希菌ATCC25922，藥敏結(jié)果的判定參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2016年的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自新加坡公司；VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；PCR試劑盒和細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA Marker購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.4生物膜測(cè)定 挑取過(guò)夜培養(yǎng)的嗜麥芽窄食單胞菌單個(gè)菌落用新鮮配制的TSB配制到D600=1(相當(dāng)于1×109cfu/mL)，再用肉湯按1∶100稀釋到D600=0.01(1×107cfu/mL)，分別吸取200 μL菌液加入到96孔微孔板中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。采用結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜麥芽窄食單胞菌生物膜形成能力[7]。首先將培養(yǎng)的平皿60 ℃固定1 h；然后棄去上清液，再用滅菌生理鹽水清洗4次；每孔加入50 μL 0.5 mg/mL結(jié)晶紫染液，室溫靜置5 min；用自來(lái)水洗去殘余染料，自然晾干；加入250 μL 33%冰醋酸溶解15 min；用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)492 nm處的吸光度(A)值來(lái)評(píng)估生物膜的形成能力。

1.5毒力基因的檢測(cè) 采用PCR方法檢測(cè)嗜麥芽窄食單胞菌的4個(gè)主要毒力基因(Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus)，所得產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，電壓5 V/cm，10 min，根據(jù)片段大小判斷有無(wú)，并計(jì)算毒力基因的攜帶率。合成引物參考文獻(xiàn)[8]，見(jiàn)表1。

表1 毒力基因引物序列表

2 結(jié) 果

2.1嗜麥芽窄食單胞菌的來(lái)源及臨床分布特點(diǎn) 79株嗜麥芽窄食單胞菌主要來(lái)自于呼吸及重癥醫(yī)學(xué)科(29例)，神經(jīng)外科(28例)，以及全科醫(yī)學(xué)科、內(nèi)分泌科、腎病血液科和骨科等。嗜麥芽窄食單胞菌感染患者中，男51例(占64.6%)，女28例(占35.4%)。<40歲2例(占2.5%)，40～<50歲3例(占3.8%)，50～<60歲4例(占5.1%)，60～<70歲9例(占11.4%)，70～<80歲11例(占13.9%)，80～<90歲26例(占32.9%)，>90歲24例(占30.4%)。菌株主要來(lái)自痰標(biāo)本62例，肺泡灌洗液6例，分泌物8例，尿液3例。79株菌株對(duì)左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑的耐藥率分別為12.6%和3.8%，未檢出對(duì)米諾環(huán)素耐藥的菌株?；颊咴诜蛛x到嗜麥芽窄食單胞菌前均應(yīng)用過(guò)2～5種抗菌藥物，其中使用3種以上的患者占64.5%，主要的抗菌藥物為頭孢菌素類(82.3%)、碳青霉烯類(53.1%)和含酶抑制劑復(fù)合制劑(63.3%)。

2.2生物膜形成能力 嗜麥芽窄食單胞菌的生物膜形成能力A492為0.50±0.42，女性患者生物膜形成能力A492為0.54±0.41，男性患者A492為0.48±0.44，男、女性患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3毒力基因檢測(cè) 毒力基因檢測(cè)顯示，Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus的陽(yáng)性率較高，分別為75.9%、91.1%、93.7%和44.3%。

3 討 論

嗜麥芽窄食單胞菌是一種常見(jiàn)的醫(yī)院內(nèi)機(jī)會(huì)性致病菌，隨著廣譜抗菌藥物的大量使用和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，且侵入性操作不斷增多，該菌的分離率逐年上升，給臨床治療帶來(lái)極大困難。本研究結(jié)果顯示，79株嗜麥芽窄食單胞菌主要來(lái)源于呼吸及重癥醫(yī)學(xué)科，其次是神經(jīng)外科。該類科室的患者基礎(chǔ)疾病較為復(fù)雜，自身免疫力低，同時(shí)應(yīng)用多種廣譜抗菌藥物治療，導(dǎo)致菌群失調(diào)，并且該類科室患者住院周期長(zhǎng)，多需接受機(jī)械通氣及深靜脈置管等創(chuàng)傷性操作，這些均是引起嗜麥芽窄食單胞菌醫(yī)院內(nèi)感染的易感因素[9]。

本研究結(jié)果顯示，菌株來(lái)自痰標(biāo)本62例。引起患者呼吸道感染的原因主要是由于嗜麥芽窄食單胞菌易定植于呼吸道及胃腸道，同時(shí)患者在分離到嗜麥芽窄食單胞菌前均應(yīng)用過(guò)2～5種抗菌藥物，且使用3種及以上抗菌藥物的患者占64.5%。廣譜抗菌藥物的大量使用使患者體內(nèi)正常菌群遭到破壞，而有利于嗜麥芽窄食單胞菌的生長(zhǎng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌感染以男性居多，>60歲患者占88.6%，說(shuō)明嗜麥芽窄食單胞菌感染好發(fā)于老年人等免疫力低下患者。另一方面隨著年齡增長(zhǎng)，氣管功能逐漸衰退，肺泡彈性及支氣管纖毛上皮運(yùn)動(dòng)逐漸減弱，使呼吸道清除功能減弱[10]。

本研究藥敏結(jié)果顯示，79株菌株對(duì)左氧氟沙星、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑的耐藥率分別為12.6%和3.8%，所有菌株均對(duì)米諾環(huán)素敏感，低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道[11],與劉加軍等[12]報(bào)道的結(jié)果相似。甲氧芐啶-磺胺甲噁唑是目前治療嗜麥芽窄食單胞菌的首選藥物，但是本院目前已出現(xiàn)對(duì)其耐藥的菌株，應(yīng)引起重視。國(guó)內(nèi)外已有研究表明，體外聯(lián)合用藥優(yōu)于單一用藥[13-14]。因此，臨床上針對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌感染嚴(yán)重的患者可以考慮甲氧芐啶-磺胺甲噁唑聯(lián)合其他藥物的治療方案。

革蘭陰性桿菌重要的特點(diǎn)是易形成生物膜，侵入性操作的增加使生物膜相關(guān)感染和病死率不斷增加，本研究中嗜麥芽窄食單胞菌的生物膜形成能力A492為0.50±0.42；毒力基因檢測(cè)顯示，Stmpr1、Stmpr2、smf-1、Smlt3773locus的陽(yáng)性率較高。

總之，本院嗜麥芽窄食單胞菌感染主要分布于呼吸及重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科，患者以男性居多，大多使用過(guò)3種及以上抗菌藥物，毒力基因攜帶率高，由于該菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥，要求醫(yī)生在臨床工作中注重病原學(xué)的檢驗(yàn)，針對(duì)病原菌合理選擇抗菌藥物，減少嗜麥芽窄食單胞菌的感染及耐藥菌株的產(chǎn)生。