活化的AMPK對肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的預(yù)測作用*

陳 曦,龔建平,楊小李

1.重慶市武隆區(qū)人民醫(yī)院外一科，重慶 408500；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院四川省院士工作站，四川瀘州 646000

肝硬化是肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)發(fā)生的高危因素。在我國，80%以上的肝癌患者合并肝硬化[1]。因此，尋找分子標(biāo)志物預(yù)測肝硬化向肝癌的惡性轉(zhuǎn)化，采用不同的隨訪策略，是改善肝硬化預(yù)后的重要方法。研究表明代謝異常是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動因子[2]，許多糖酵解的節(jié)點分子，如M2型丙酮酸激酶(PKM2)、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF1α)及LncRNA IDH1-AS1等，均被證實在癌癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[3-4]。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞能量狀態(tài)的“傳感器”。已有研究顯示AMPK低活化與肝癌預(yù)后不良有關(guān)[5]，AMPK的經(jīng)典激活劑二甲雙胍可抑制肝癌發(fā)生[6]，因此，AMPK的活化異?？赡芫哂蓄A(yù)測肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的作用。在本研究中，筆者檢測肝硬化組織標(biāo)本中活化的AMPK(p-AMPK)的表達(dá)，分析其與肝癌發(fā)生的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1999年1月至2011年6月因肝硬化門靜脈高壓癥在重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院行Hassab聯(lián)合肝活檢術(shù)的患者。排除無法獲取詳盡的臨床資料215例，組織標(biāo)本不足以制作組織芯片147例，未規(guī)律隨訪158例。最終制作完成的組織芯片來自426例肝硬化患者(以下簡稱重醫(yī)隊列)。本研究方案經(jīng)由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批(批號：2016-102)，所納入患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 試劑：SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋：SP9001)，p-AMPK(Thr172)抗體 (CST：8208)。

1.3方法 隨訪時間間隔為3～6個月，隨訪常規(guī)項目包括血常規(guī)、肝腎功能、甲胎蛋白(AFP)和腹部彩超，如果有可疑肝癌病灶，則進(jìn)一步行增強(qiáng)CT、MRI或肝穿刺活檢。筆者將Hassab術(shù)后仍有每周大于1次的飲酒定義為有飲酒史，將手術(shù)后發(fā)生過上消化道出血定義為有上消化道出血史。2型糖尿病的診斷參照國際通用WHO(1999年)標(biāo)準(zhǔn)。隨訪終點為發(fā)現(xiàn)肝癌或至2016年12月，中位隨訪時間87.0個月。

采用四川大學(xué)華西醫(yī)院石毓君教授贈予的組織芯片進(jìn)一步驗證本研究結(jié)果，該組織芯片包含1995-2009年在華西醫(yī)院取得的152份乙型肝炎后肝硬化標(biāo)本，最終納入131份采用Hassab手術(shù)患者的標(biāo)本作為驗證隊列(以下簡稱華西隊列)。華西醫(yī)院與重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的隨訪時間間隔及隨訪項目相同，隨訪終點為發(fā)現(xiàn)肝癌或至2014年5月，中位隨訪時間84.5個月。標(biāo)本收集時已通過華西醫(yī)院倫理委員會審查。

1.4免疫組化結(jié)果判讀 (1)染色深度：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為黃或深黃色，3分為褐或棕褐色；(2)陽性細(xì)胞數(shù)：0分為陽性細(xì)胞數(shù)≤5%，1分為陽性細(xì)胞數(shù)>5%～25%，2分為陽性細(xì)胞數(shù)>25%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)>50%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)>75%；染色深度與陽性細(xì)胞數(shù)得分相加為總得分，總得分0～1為陰性，2～3為弱陽性，4～8為中等陽性，9～12為強(qiáng)陽性，將陰性與弱陽性歸為p-AMPK低表達(dá)組;中等陽性與強(qiáng)陽性歸為p-AMPK高表達(dá)組。兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法觀察，若有爭議，最終協(xié)商一致的結(jié)果為最終結(jié)果。陽性對照為已知p-AMPK高表達(dá)的肝組織切片，陰性對照為不加一抗的磷酸緩沖鹽溶液。

2 結(jié) 果

2.1肝硬化組織中p-AMPK的表達(dá)與基本臨床資料的關(guān)系 p-AMPK陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。332例(77.9%)為p-AMPK高表達(dá)，94例(22.1%)為p-AMPK低表達(dá)。p-AMPK低表達(dá)組有上消化道出血史、Child-Pugh B或C級及糖尿病的患者所占比例均高于p-AMPK高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同p-AMPK表達(dá)水平的患者年齡、性別、病因、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、AFP、腹腔積液、飲酒史和肝性腦病差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同p-AMPK表達(dá)水平患者臨床資料的比較(重醫(yī)隊列)

續(xù)表1 不同p-AMPK表達(dá)水平患者臨床資料的比較(重醫(yī)隊列)

圖1 p-AMPK在肝硬化組織中表達(dá)的典型免疫組化圖

2.2p-AMPK的表達(dá)與肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)性分析 隨訪結(jié)束后，非肝癌致死61例(14.3%)，發(fā)生肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化41例(9.6%)。Hassab術(shù)后1、3、5、10年，p-AMPK低表達(dá)與p-AMPK高表達(dá)患者肝癌發(fā)生率分別為3.1%、9.6%、13.8%、30.6%和0.0%、0.3%、0.3%、8.0%。Fine and Gray模型分析顯示，p-AMPK低表達(dá)組具有更高的肝癌發(fā)生率，見圖2。單因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達(dá)是肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的危險因素(HR=6.25，95%CI:3.36～11.60，P<0.001)。多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達(dá)是肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的獨立危險因素(HR=6.00,95%CI:3.24～11.10,P<0.001)。以Child-Pugh分級、糖尿病和飲酒史進(jìn)行分層研究，同樣顯示p-AMPK的表達(dá)水平與肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化率呈負(fù)相關(guān)，見圖3。

圖2 重醫(yī)隊列p-AMPK的表達(dá)對肝癌發(fā)生的影響

注：A、D為以糖尿病分層時肝癌發(fā)生情況；B、E為以飲酒史分層時肝癌發(fā)生情況；C、F為以Child-Pugh分級分層時肝癌發(fā)生情況。圖3 重醫(yī)隊列p-AMPK對肝癌發(fā)生的影響亞組分析

2.3華西隊列檢驗p-AMPK與肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生的相關(guān)性 華西隊列中ALT水平低于重醫(yī)隊列，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；華西隊列中肝硬化的病因均為HBV感染，男性和Child-Pugh B或C級患者的比例低于重醫(yī)隊列，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其余已知變量在兩個隊列之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。華西隊列中，p-AMPK低表達(dá)患者與重醫(yī)隊列相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。p-AMPK低表達(dá)組ALT和AST水平高于p-AMPK高表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余已知變量在兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。Fine and Gray模型分析結(jié)果與重醫(yī)隊列相似，p-AMPK低表達(dá)組具有更高的肝癌發(fā)生率，見圖4。單因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達(dá)是肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的危險因素(HR=8.49，95%CI：2.93～24.6，P<0.001)。多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達(dá)是肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的獨立危險因素(HR=13.40,95%CI:5.14～34.90,P<0.001)。

圖4 華西隊列p-AMPK的表達(dá)對肝癌發(fā)生的影響

表2 華西隊列與重醫(yī)隊列患者基本信息比較

續(xù)表2 華西隊列與重醫(yī)隊列患者基本信息比較

表3 不同p-AMPK表達(dá)水平患者臨床資料的比較(華西隊列)

3 討 論

AMPK是細(xì)胞“能量調(diào)節(jié)器”，低能量會激活A(yù)MPK，增強(qiáng)產(chǎn)能代謝并抑制耗能代謝，從而維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)AMPK與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[5-6]。敲除AMPK α亞基抑制AMPK活化可促進(jìn)有氧糖酵解(Warburg 效應(yīng)，癌細(xì)胞的主要代謝特征)，加速Myc 誘導(dǎo)的淋巴瘤發(fā)生[7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1(TAK 1)是AMPK的上游活化因子，敲除TAK 1可抑制AMPK活化，導(dǎo)致小鼠自發(fā)肝纖維化和肝癌[8]。二甲雙胍是AMPK的激活劑，長期服用二甲雙胍的肝硬化患者肝癌發(fā)生率明顯降低[9]。同時，AMPK還是治療纖維化疾病的重要靶點，AMPK激活后可抑制肝星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖，減輕硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化[10]。ZHENG等[5]發(fā)現(xiàn)p-AMPK低表達(dá)是肝癌預(yù)后不良的獨立危險因素。有研究結(jié)果表明，p-AMPK發(fā)揮了抑制肝纖維化和抑制腫瘤發(fā)生的雙重作用。

雖然目前已發(fā)現(xiàn)大量與肝癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物，包括蛋白、lncRNA、miRNA等，但預(yù)測肝硬化向肝癌惡性轉(zhuǎn)化的分子標(biāo)志物卻鮮見報道，其主要原因主要包括以下幾點：(1)因肝癌發(fā)生率低，因此統(tǒng)計學(xué)上需要大量的肝硬化組織標(biāo)本；(2)肝癌的發(fā)生是一個漸進(jìn)的過程，臨床上很難判斷出肝癌發(fā)生的準(zhǔn)確時間節(jié)點；(3)肝硬化患者僅有一小部分接受手術(shù)治療，故肝硬化組織標(biāo)本的獲取非常困難。本研究共收集了來自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和四川大學(xué)華西醫(yī)院的共557份肝硬化組織標(biāo)本，經(jīng)過長時間的隨訪獲得了肝癌發(fā)生相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，首次發(fā)現(xiàn)p-AMPK具有預(yù)測肝硬化患者肝癌發(fā)生的作用，可作為預(yù)測肝癌發(fā)生的潛在分子標(biāo)志物。

本研究尚有以下不足之處：(1)HBV導(dǎo)致的肝硬化分別占重醫(yī)隊列的85.7%、華西隊列的100.0%，且均為需要通過手術(shù)預(yù)防或治療上消化道出血的患者，即所有患者均為失代償期肝硬化，研究的結(jié)果是否可應(yīng)用于其他病因所導(dǎo)致的肝硬化或者代償期肝硬化患者仍需進(jìn)一步探討；(2)因臨床上很難判斷出肝癌發(fā)生的準(zhǔn)確時間節(jié)點，筆者也無法獲得肝癌發(fā)生的準(zhǔn)確時間節(jié)點，但本研究嚴(yán)格納入每3～6個月規(guī)律隨訪的患者進(jìn)行分析，將肝癌發(fā)生的時間鎖定在3～6個月內(nèi)，獲得了一個相對準(zhǔn)確的肝癌發(fā)生數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，p-AMPK的表達(dá)與糖尿病、上消化道出血和Child-Pugh B或C級有關(guān)，F(xiàn)ine and Gray模型分析提示，p-AMPK的表達(dá)水平與肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化呈負(fù)相關(guān)，多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達(dá)是肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的獨立危險因素。提示AMPK可能在肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化中扮演關(guān)鍵角色，可作為預(yù)測肝硬化-肝癌惡性轉(zhuǎn)化的潛在分子標(biāo)志物。