母嬰分離應(yīng)激對(duì)幼年大鼠腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2及微管動(dòng)態(tài)性影響☆

魏艷艷 陳景旭 吳作天 肖玲 何靜 張楠 王高華

生命早期是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[1]。早年應(yīng)激事件可對(duì)個(gè)體產(chǎn)生持久影響，與抑郁癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。不同程度早年應(yīng)激對(duì)個(gè)體具有不同影響[2]，其產(chǎn)生的作用類似于U型曲線，適度溫和的應(yīng)激會(huì)使動(dòng)物成年后表現(xiàn)優(yōu)于未應(yīng)激或嚴(yán)重應(yīng)激大鼠，而其具體發(fā)生機(jī)制目前并不清楚[3]。腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsin response mediator protein 2，CRMP2）在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白相互作用調(diào)節(jié)骨架動(dòng)態(tài)性[4]。而其活性及功能受翻譯后修飾方式影響，磷酸化是其主要修飾形式，磷酸化修飾可導(dǎo)致其與微管蛋白解聚，降低微管動(dòng)態(tài)性，導(dǎo)致神經(jīng)可塑性受損[5]。而目前關(guān)于母嬰分離（maternal separation，MS）的研究多集中在應(yīng)激對(duì)成年大鼠神經(jīng)生物學(xué)影響，對(duì)幼年大鼠神經(jīng)可塑性影響的研究較少。本研究旨在研究不同程度母嬰分離應(yīng)激對(duì)幼年大鼠海馬CRMP2、P-CRMP2及微管動(dòng)態(tài)性的影響，探討早年應(yīng)激對(duì)幼年大鼠神經(jīng)生物學(xué)影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 10只孕期15～16 d的SPF級(jí)SD孕鼠（華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入），在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF環(huán)境單籠飼養(yǎng)，安置在12 h:12 h光暗周期的環(huán)境中，自由獲取食物和水，并保持恒定的溫度 （22±1）℃和濕度50%±10%。盡量減少環(huán)境刺激，每天定期觀察孕鼠生產(chǎn)情況。孕鼠生產(chǎn)的36只新生雄性幼鼠納入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 將36只新生雄性幼鼠隨機(jī)分為3組，包括母嬰分離360 min組（MS360）、母嬰分離 15 min 組（MS15）以及對(duì)照組（NC），每組12只。其中MS360組和MS15組從出生后第4～10天進(jìn)行連續(xù)1周給予母嬰分離應(yīng)激，從早上9點(diǎn)開(kāi)始將幼鼠從母鼠籠中轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，每日分離360 min或15 min。在分離結(jié)束后，幼崽送回母鼠籠中與母鼠團(tuán)聚。NC組不進(jìn)行母嬰分離。對(duì)3組幼崽進(jìn)行相同次數(shù)的撫觸，以確保檢測(cè)到的差異都只是由于分離時(shí)間的不同而產(chǎn)生。

1.2.2 標(biāo)本采集 應(yīng)激結(jié)束后處死幼鼠，迅速在冰面上剝離海馬組織，置于-80℃保存待用。

1.2.3 檢測(cè)海馬CRMP2、tubulin、actin的mRNA表達(dá) 使用q-RT-PCR方法。每組取6只幼鼠海馬組織，用Trizol提取RNA，采用RevertAid First strand cDNA systhesis Kit#1622試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNAs。采用 SYBR?Premix Ex TaqTM RR820A試劑盒在CFX96型qPCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物由谷歌生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。以 GAPDH的 Ct值為參照，采用2-ΔΔCt反映mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 檢測(cè)海馬CRMP2、P-CRMP2及微管動(dòng)態(tài)性相關(guān)蛋白表達(dá) 使用Western-Blot方法。每組剩余6只幼鼠海馬組織，采用RIPA裂解液進(jìn)行裂解勻漿，離心后收集蛋白上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。將蛋白樣品煮沸變性，取適量樣品（20 μg）進(jìn)行 10% SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后分別加入抗CRMP2抗體（ab129082,1:200000）、抗 P-CRMP2 抗體（ab85934,Thr514 位點(diǎn)，7 μL:5 mL）、抗 tubulin 抗體（ab7291,1:5000）、抗 Tyr-tubulin抗體 （T9028,1:2500）、抗 Acettubuin 抗體（sc-23950,1:200）、抗 actin 抗體（sc-8432,1:250）以及抗 GAPDH抗體 （#2118,1:1000），4℃搖床孵育過(guò)夜。次日加入對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育1 h，在PVDF膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，置于BIO-RAD ChemiDoc Touch Image System儀器上進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用Image-Lab軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，將GAPDH的灰度值作為參照標(biāo)準(zhǔn)。

表1 q-RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 海馬 CRMP2、tubulin、actin的 mRNA 表達(dá)水平 MS360組、MS15組以及NC組海馬CRMP2、tubulin、actin的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 2。

2.2 海馬CRMP2、P-CRMP2及微管動(dòng)態(tài)性相關(guān)蛋白表達(dá)水平 3組的P-CRMP2蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=11.172,P=0.001），MS360組高于 MS15組及 NC 組（P＜0.01），MS15組與 NC 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組Tyr-tubulin水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=4.311,P=0.049），MS360組較 MS15組及 NC組下降 （P＜0.05），MS15組與NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）。3組Acet-tubulin水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=8.939,P=0.003），MS360組高于 MS15 組及 NC 組 （P＜0.01），MS15組與 NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）。CRMP2、tubulin、actin蛋白表達(dá)水平3組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖 1 及表 3。

3 討論

嚙齒類動(dòng)物母嬰分離模型是目前公認(rèn)的早年應(yīng)激模型。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)不同程度母嬰分離應(yīng)激對(duì)成年后行為具有不同影響：短期母嬰分離應(yīng)激可促進(jìn)個(gè)體出現(xiàn)應(yīng)激抵抗，避免抑郁樣行為的產(chǎn)生；而長(zhǎng)期母嬰分離則會(huì)導(dǎo)致個(gè)體出現(xiàn)應(yīng)激敏感，出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為[2,6]。其發(fā)生機(jī)制目前并未闡明，且目前研究多集中在母嬰分離應(yīng)激模型成年后神經(jīng)生物學(xué)指標(biāo)改變，對(duì)幼年時(shí)期神經(jīng)可塑性影響的研究較少，故本研究旨在探索不同程度母嬰分離應(yīng)激對(duì)幼年大鼠神經(jīng)可塑性機(jī)制的影響。

圖1 母嬰分離應(yīng)激后3組幼鼠海馬各蛋白表達(dá)灰度圖 NC為對(duì)照組；MS15為母嬰分離15 min組；MS360為母嬰分離360 min組。

表 2 幼鼠海馬 CRMP2、tubulin、actin 的 mRNA 表達(dá)水平（2-ΔΔCt）

表3 幼鼠海馬各蛋白表達(dá)水平

本研究結(jié)果顯示長(zhǎng)期母嬰分離導(dǎo)致幼鼠海馬P-CRMP2表達(dá)水平升高，而短期母嬰分離并未引起P-CRMP2水平改變，并且兩者均未影響海馬CRMP2水平。提示長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激主要對(duì)幼年大鼠海馬CRMP2的磷酸化水平產(chǎn)生影響，而對(duì)CRMP2的總體蛋白及mRNA水平無(wú)明顯影響，而短期母嬰分離應(yīng)激對(duì)幼鼠海馬CRMP2及PCRMP2均未產(chǎn)生影響。CRMP2與神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，并在微管動(dòng)態(tài)性調(diào)節(jié)、軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)元極化及遷移等調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7]。磷酸化是CRMP2主要修飾形式，CRMP2磷酸化可導(dǎo)致其與tubulin等下游分子的結(jié)合能力受損，進(jìn)而影響微管聚合及軸突生長(zhǎng)等功能[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)CRMP2與應(yīng)激、精神疾病有密切關(guān)聯(lián)[9]。尸腦蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦內(nèi)CRMP2的表達(dá)水平較對(duì)照組下降[10]，慢性不可預(yù)計(jì)性應(yīng)激小鼠模型腦內(nèi)CRMP2表達(dá)水平亦下降[11]?？挂钟羲幬锟捎绊懩X內(nèi)CRMP2的水平，情緒穩(wěn)定劑鋰鹽可降低腦內(nèi)CRMP2的磷酸化水平[12]。這些研究均提示CRMP2以及P-CRMP2在應(yīng)激、抑郁癥的發(fā)病機(jī)制以及抗抑郁藥物作用機(jī)制中起著重要作用。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)早年長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激與抑郁癥密切相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致個(gè)體成年后出現(xiàn)抑郁癥等精神疾病[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)早年長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致幼鼠海馬P-CRMP2水平升高，結(jié)合以上文獻(xiàn)結(jié)果，提示大鼠成年后出現(xiàn)抑郁癥等精神疾病可能與個(gè)體幼年時(shí)期海馬CRMP2的磷酸化水平改變有關(guān)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)早年母嬰分離應(yīng)激對(duì)CRMP2總體水體有影響，卻發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致幼年大鼠CRMP2的磷酸化水平升高，提示不同時(shí)間及不同程度應(yīng)激可能對(duì)大腦產(chǎn)生不同影響[14]。

細(xì)胞支架在神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，微管動(dòng)態(tài)性變化是神經(jīng)元形態(tài)、功能以及生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)[15]。tubulin為微管蛋白，actin為微絲蛋白，均為細(xì)胞支架的構(gòu)成蛋白。乙?；⒐艿鞍祝ˋcet-tubulin）及酪氨酸化微管蛋白（Tyr-tubulin）為tubulin的修飾形式，Acet-tubulin為穩(wěn)定微管標(biāo)志物，Tyr-tubulin為動(dòng)態(tài)微管標(biāo)志物[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致Tyr-tubulin表達(dá)下降，Acet-tubulin表達(dá)升高，而短期母嬰分離應(yīng)激并未影響其表達(dá)水平，提示長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致微管動(dòng)態(tài)性下降、神經(jīng)可塑性受損，而短期母嬰分離未影響微管動(dòng)態(tài)性。并且本研究發(fā)現(xiàn)早年應(yīng)激并未影響 tubulin、actin蛋白及 mRNA表達(dá)水平。既往關(guān)于抑郁動(dòng)物模型的研究發(fā)現(xiàn)其海馬Acet-tubulin升高，Tyr-tubulin下降，存在微管動(dòng)態(tài)性受損[17]，提示應(yīng)激導(dǎo)致抑郁樣行為的發(fā)生機(jī)制可能與微管動(dòng)態(tài)性受損有關(guān)。本研究與其研究結(jié)果相似，且發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致CRMP2磷酸化水平顯著升高。既往研究發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾可降低其與微管蛋白結(jié)合，影響微管的聚合與解聚動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[5]。因此早年長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致微管動(dòng)態(tài)性下降的機(jī)制可能與CRMP2磷酸水平升高相關(guān)。

本研究還存在一定的局限性：研究材料均為雄性幼鼠，未進(jìn)行雌性幼鼠的研究；此外，只檢測(cè)了幼鼠神經(jīng)生物學(xué)指標(biāo)，未進(jìn)行成年后大鼠行為學(xué)及神經(jīng)生物學(xué)指標(biāo)的研究。下一步研究需擴(kuò)大范圍，將雌鼠及成年鼠納入研究，從而得到更有說(shuō)服力的研究成果，以期為探明早年應(yīng)激的神經(jīng)病理學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，早年長(zhǎng)期母嬰分離應(yīng)激導(dǎo)致幼年大鼠海馬微管動(dòng)態(tài)性下降，神經(jīng)可塑性受損，這一過(guò)程的可能機(jī)制源于CRMP2的磷酸化水平升高；而短期母嬰分離并未影響微管動(dòng)態(tài)性及CRMP2的磷酸化水平。不同程度母嬰分離應(yīng)激在大鼠幼年時(shí)期已經(jīng)引起海馬發(fā)生不同的生化改變，這可能是早年應(yīng)激導(dǎo)致成年后行為發(fā)生改變的基礎(chǔ)，本研究對(duì)于進(jìn)一步闡明應(yīng)激影響的神經(jīng)機(jī)制研究具有一定啟發(fā)意義。