枳實(shí)藥材的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜

陳 鑫，陳玉宇

(泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會(huì)，江蘇 泰州 225300)

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果[1]，植物形態(tài)為常綠小喬木，有長(zhǎng)刺。單葉互生，革質(zhì)，葉柄有狹長(zhǎng)形或倒心臟形的翼；葉片長(zhǎng)橢圓形，有半透明油點(diǎn)；花排列成總狀花序；花萼杯狀，5裂；花瓣5，白色，長(zhǎng)橢圓形；柑果圓形而稍扁，成熟時(shí)橙黃色?；ㄆ?～5月，果期6～11月。枳實(shí)呈半球形，少數(shù)為球形，直徑0.5～2.5 cm。外果皮黑綠色或暗棕綠色，具顆粒狀突起和皺紋，有明顯的花柱殘跡或果梗痕，切面中果皮略隆起，厚0.3～1.2 cm，黃白色或黃褐色，邊緣有1～2列油室，瓤囊棕褐色，質(zhì)地堅(jiān)硬。氣清香，味苦、微酸。主產(chǎn)于四川、江西、福建、江蘇等地，具有破氣消積、化痰散痞等功效。主要用于積滯內(nèi)停，痞滿脹痛，瀉痢后重，大便不通，痰滯氣阻，胸痹，結(jié)胸，臟器下垂等。目前，對(duì)于枳實(shí)藥材的研究，雖然除了對(duì)于主要化學(xué)成分的含量測(cè)定以外，也包含大量的HPLC圖譜研究和其他指紋圖譜，但也存在一些不足。目前已有文獻(xiàn)[2-17]對(duì)枳實(shí)的指紋圖譜進(jìn)行研究，標(biāo)定了其中一些有效成分，本文在此基礎(chǔ)上采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS聯(lián)用色譜技術(shù)建立了枳實(shí)高效液相色譜指紋圖譜，經(jīng)黃酮類標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照和HPLC-ESI/DAD-TOF-MS總離子流信息鑒定10個(gè)共有峰，進(jìn)而建立了14批枳實(shí)特征色譜指紋圖譜，此方法將色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用在枳實(shí)的指紋圖譜分析中，方法新穎、特征峰多、信息量大的良好特點(diǎn)，這種相結(jié)合的分析方法是科學(xué)的、系統(tǒng)的、全面的，從而有利于中藥科學(xué)的質(zhì)量控制，為枳實(shí)的全面研究提供參考；為該藥的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供重要參考依據(jù)和有力手段；也為全面探究枳實(shí)活性成分提供了切實(shí)的依據(jù)。本文建立的枳實(shí)藥材綜合指紋圖譜，采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)不同產(chǎn)地不同生產(chǎn)廠家的枳實(shí)藥材進(jìn)行了差異甄別，為鑒定枳實(shí)藥材成分差異、控制藥材質(zhì)量奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)，使其生產(chǎn)達(dá)到規(guī)范化、穩(wěn)定化、現(xiàn)代化，為其它天然藥物的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Shimadazum LC-10Advp高效液相系統(tǒng)；配套真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器及柱溫箱；UV檢測(cè)器；LC-Solution工作站；

Agilent 1260高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent；Agilent 6224 TOF-LC-MS系統(tǒng)，配備電噴霧離子源(ESI 源)以及Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00質(zhì)譜工作站軟件，美國(guó)Agilent；AB135-S分析天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；LIBROR AEU-210 1/1 萬電子天平，Japan Shimadzu；KQ-500VDB型超聲波清洗器，昆山超聲儀器廠；Beckman Avanit J-E高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman coulter；CW130粉碎機(jī)，上海天祥健臺(tái)制藥機(jī)械有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海索譜儀器有限公司。

1.2 材 料

枳實(shí)品種如表1所示，經(jīng)鑒定為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種或甜橙(CitrussinensisOsbeck.)的干燥幼果，樣本現(xiàn)保存于江蘇省南京市中國(guó)藥科大學(xué)。

對(duì)照品：柚皮苷(分子式C27H32O14，CAS號(hào)10236-47-2，批號(hào)：12030612)，橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS號(hào)250-26-3，批號(hào)：12020304)，新橙皮苷(分子式C28H34O15，CAS號(hào)13241-33-3，批號(hào)：12030701)對(duì)照品均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，規(guī)格均為20 mg/支，純度≥98%。

試劑：甲醇(特級(jí)純)，南京晚晴化玻儀器有限公司；乙酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

表1 不同產(chǎn)地及不同炮制品的枳實(shí)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

帶有預(yù)柱的漢邦Phecda C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min (5%～15% B, 95%～85% A)，10～15 min (15%～20% B, 85%～80% A)，15～20 min (20%～30% B, 80%～70% A)，20～25 min (30%～36% B, 70%～64% A)，25～40 min (36% B, 64% A)，40～45 min (36%～65% B, 64%～35% A)，45～50 min (65%～80% B, 35%～20% A)，50～55 min (80%～95% B, 20%～5% A)，55～60 min (95% B, 5% A)，60～65 min(95%～5%B, 5%～95% A)，65～75 min (5% B, 95% A)；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm；進(jìn)樣量10 μL；分析時(shí)間為75 min。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧(ESI)離子源；采用正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)；脫氣溶劑氣流量8 L·min-1；脫氣溶劑溫度350 ℃；霧化室壓力：30 Psig；毛細(xì)管電壓3.5 kV；TOF檢測(cè)電壓120 V；捕捉電壓65 V；每1 s采集一次圖譜；全掃描(MS scan)，質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～1000；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00質(zhì)譜工作站軟件處理。

2.3 供試品溶液的制備

取14份不同的枳實(shí)藥材適量，采用CW130粉碎機(jī)粉碎，在溫度為60 ℃下烘干。分別稱取枳實(shí)藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，用KQ-500VDB型超聲波清洗器設(shè)置超聲提取時(shí)間為30 min，放冷，過濾，濾液置50 mL容量瓶中，濾渣重復(fù)提取1次，合并濾液，定容。提取液于高速離心機(jī)下16000 r·min-1離心10 min，取上清，進(jìn)樣。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱量新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷對(duì)照品適量，用適量甲醇溶解配成濃度約1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，分別稀釋至所需的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。-20 ℃保存，備用。待進(jìn)液相和質(zhì)譜。

2.5 測(cè)定方法

精密量取上述混合供試品溶液和對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，分析時(shí)間為75 min，注入高效液相色譜儀和Agilent 1260高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器及Agilent 6224 TOF-LC-MS系統(tǒng)，記錄時(shí)間為75 min色譜圖，色譜圖見圖1和圖2，質(zhì)譜圖見圖5和圖6。

圖1 枳實(shí)藥材供試品的高效液相色譜圖

圖2 對(duì)照品指紋圖譜

2.6 方法學(xué)考察[2]

2.6.1 精密度實(shí)驗(yàn)

分別吸取同一(本實(shí)驗(yàn)選擇的編號(hào)為S1枳實(shí)樣品)供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄高效液相色譜圖。計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明：所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值小于0.32%，相對(duì)峰面積的RSD值小于1.25%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一(本實(shí)驗(yàn)選擇的編號(hào)為S1枳實(shí)樣品)供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣6次。計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明：所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值小于0.12%，相對(duì)峰面積的RSD值小于1.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批枳實(shí)(本實(shí)驗(yàn)選擇的編號(hào)為S1枳實(shí)樣品)6份，按照枳實(shí)供試品溶液的制備方法平行制備供試品溶液，記錄高效液相色譜圖。計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果表明：所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值小于0.25%，相對(duì)峰面積的RSD值小于2.18%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 枳實(shí)藥材指紋圖譜的建立、測(cè)定及分析[19]

2.7.1 指紋圖譜分析軟件的應(yīng)用

按照上述確定的色譜-質(zhì)譜條件和供試品溶液的制備方法，測(cè)定了14批不同產(chǎn)地和不同炮制方法的枳實(shí)的色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的指紋圖譜。因圖譜中各個(gè)物質(zhì)分離度良好，含量較高，所以選其作為枳實(shí)藥材質(zhì)量和活性的指標(biāo)。采用國(guó)家藥典委編的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版》。參數(shù)設(shè)置如下：采用序號(hào)S1枳實(shí)樣品作為相似度計(jì)算時(shí)校正的參照?qǐng)D譜；選取0.10 min為“時(shí)間窗寬度”；選用多點(diǎn)校正的“校正方式”。

圖3 14批枳實(shí)藥材的高效液相指紋重疊圖譜(S1～S14代表樣品組別從1到14)

高效液相色譜指紋圖譜的生成：選擇編號(hào)從S1到S14的共14批枳實(shí)藥材色譜圖生成高效液相色譜重疊圖譜見圖3，軟件生成的對(duì)照高效液相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜見圖4，通過軟件就算的相似度計(jì)算結(jié)果見表3。

圖4 軟件生成的枳實(shí)藥材對(duì)照指紋圖譜

圖5 放大的枳實(shí)藥材總離子流圖譜

圖6 枳實(shí)(樣品1)總提取物的正離子模式(a)和負(fù)離子模式總離子流圖(b)

2.7.2 共有峰的確定

精密量取14批枳實(shí)供試品溶液，記錄枳實(shí)藥材總離子流色譜圖，通過比對(duì)相同保留時(shí)間的紫外光譜圖，最終選擇了10個(gè)特征峰作為指紋圖譜的共有峰，見圖5。經(jīng)HPLC-ESI/DAD-TOF-MS檢測(cè)得到枳實(shí)中各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，并結(jié)合提取離子流圖(“ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI(-)/DAD-TOF-MS”的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)，見圖(6)及與對(duì)照品、相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[20-31]對(duì)比，從而對(duì)枳實(shí)進(jìn)行化學(xué)成分確認(rèn)，樣品中分析鑒定的成分見表2。

枳實(shí)藥材的總離子流色譜圖中，保留時(shí)間為39.886 min，43.696 min處出現(xiàn)2個(gè)色譜峰，它們具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量，但具有不同的保留行為，其提取離子色譜圖見圖6。其中，通過與對(duì)照品比對(duì)，確定保留時(shí)間為39.886 min的色譜峰為新橙皮苷，43.696 min的色譜峰為橙皮苷。

其中tR為34.833 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為581，579的離子峰，其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與柚皮苷對(duì)照品相一致，據(jù)此確定該化合物為柚皮苷。tR為39.886 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為611，609的離子峰，其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與新橙皮苷對(duì)照品相一致，據(jù)此確定該化合物為新橙皮苷。tR為43.696 min的峰在ESI+，ESI-模式下分別得到m/z為611，609的離子峰，其保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與橙皮苷對(duì)照品相一致，據(jù)此確定該化合物為橙皮苷。

tR為28.886 min，相對(duì)分子質(zhì)量596.1736，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C27H32O15，可知是圣草次苷或新北美圣草苷。

tR為29.781 min，相對(duì)分子質(zhì)量535.1624，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C22H31O15，可知是苦橙甙(aurantiamar)。

同時(shí)根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)，將各物質(zhì)出峰的先后順序、ESI+，ESI-模式下分別得到m/z等與文獻(xiàn)中的信息相比對(duì)，以及采用軟件處理得到的誤差，可以推測(cè)tR為26.014 min的色譜峰m/z理論值為178.0266，m/z實(shí)測(cè)值為178.031，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C9H6O4，可判斷為6,7-二羥基香豆素；tR為46.280 min的色譜峰的色譜峰m/z理論值為578.1636，m/z實(shí)測(cè)值為578.1636，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C27H30O14，可判斷為野漆樹苷；tR為48.665 min的色譜峰m/z 理論值為302.079，m/z實(shí)測(cè)值為302.0776，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C16H14O6，可判斷為橙皮素；tR為52.277 min的色譜峰m/z 理論值為342.1103，m/z實(shí)測(cè)值為342.1099，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C19H18O6，可判斷為3',4',7,8-四甲氧基黃酮；tR為54.696 min的色譜峰m/z理論值為388.1158，m/z實(shí)測(cè)值為388.113，采用Mass Hunter B.04軟件處理得到分子式為C20H20O8，可判斷為單羥基五甲氧基黃酮。

最終選擇確定這10個(gè)峰作為指紋圖譜的共有峰，其中峰1為6,7-二羥基香豆素，峰2為圣草次苷或新北美圣草苷(二者為同分異構(gòu)體)，峰3為苦橙苷， 峰4為柚皮苷，峰5為橙皮苷，峰6為新橙皮苷，峰7為野漆樹苷，峰8為橙皮素，峰9為3',4',7,8-四甲氧基黃酮，峰10為單羥基五甲氧基黃酮。

表2 枳實(shí)提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS數(shù)據(jù)及成分鑒定

2.7.3 特征指紋峰的分析

表3 14批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度計(jì)算軟件2004 A版》對(duì)14批枳實(shí)的指紋圖譜進(jìn)行分析，14批枳實(shí)之間的相似度和生成的對(duì)照指紋圖譜的相似度如表3所示。從表3可以看出，14批枳實(shí)的相似度在0.560～0.958之間，14 批枳實(shí)藥材與生成的對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.572～0.965之間，不同來源、不同批次的枳實(shí)藥材的特征峰峰高有明顯的差異，且相似度也有顯著的差異。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC-DAD/ESI-TOF-MS技術(shù)對(duì)枳實(shí)中的生物堿類和黃酮類成分進(jìn)行快速分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜獲得的母離子信息，結(jié)合對(duì)照品以及參考文獻(xiàn)[20-31]，對(duì)枳實(shí)中多種化學(xué)成分進(jìn)行了鑒定，為該藥材的GAP提供參考。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)枳實(shí)藥材高效液相指紋圖譜的構(gòu)建進(jìn)行了探討，可為枳實(shí)藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)的依據(jù)。在其他條件相同的情況下，不同批次枳實(shí)藥材提取所得的14批枳實(shí)藥材醇提液的特征峰高及相似度差異較大。因此，采用高效液相指紋圖譜技術(shù)對(duì)枳實(shí)的質(zhì)量控制是極有必要的，可以采用指定廠家，到符合GAP生產(chǎn)管理規(guī)范的基地購(gòu)買道地枳實(shí)藥材。本方法學(xué)建立了枳實(shí)藥材HPLC-ESI/DAD-TOF-MS聯(lián)用色譜技術(shù)的高效液相色譜指紋圖譜，能更好更全面地控制枳實(shí)藥材的質(zhì)量。10 峰分別體現(xiàn)了枳實(shí)藥材的特征，不僅為枳實(shí)藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了部分依據(jù)，也為其整體上進(jìn)行質(zhì)量控制奠定了夯實(shí)的基礎(chǔ)，充分體現(xiàn)了中醫(yī)臨床用藥的特色，為延續(xù)挖掘傳統(tǒng)中藥復(fù)方的特色提供了有利手段。