鏈格孢霉菌毒素的研究進展*

郭詩曼，馮 啟

(浙江外國語學院科學技術學院，浙江 杭州 310023)

鏈格孢霉菌(Alternariatoxins) 是一種絲狀真菌，在蔬菜、水果及谷物中的病原體和腐生菌中多有發(fā)現(xiàn)[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些代謝產(chǎn)物具有致突變、致癌、致畸、致死、細胞毒性、基因毒性、胚胎毒性、急性毒性等毒性[2]，比如研究人員發(fā)現(xiàn)了某些代謝物與人類食道癌密切相關[3]。農作物被該菌侵染之后會出現(xiàn)小麥黑斑病、柑橘黑斑病等常見的病害，造成糧食減產(chǎn)或水果腐爛。鏈格孢霉菌的污染地域也十分廣闊，遍及歐洲、美洲及亞洲。歐洲食品安全局已經(jīng)對鏈格孢霉毒素進行了風險評估，認為具有遺傳毒性的交鏈孢酚與交鏈孢酚單甲醚應該引起人們的重視[4]。而此前，該菌都未引起學者的關注，考慮其污染范圍、污染物種及毒理性質，目前已經(jīng)有越來越多的科學家著手研究鏈格孢霉毒素。但是目前全世界范圍內都沒有定制鏈格孢霉菌毒素的限量標準。本文詳細綜述了鏈格孢霉菌毒素的毒理性質與污染現(xiàn)狀，概述了檢測方法，旨在推動我國盡快建立關于鏈格孢霉菌毒素的標準與規(guī)范。

1 簡介與毒理性質

鏈格孢霉菌是一種廣泛分布于泥土的真菌，能通過田間侵染、貯存接觸等途徑污染農作物。值得注意的是，由于鏈格孢霉菌能在低溫環(huán)境下完成生長繁殖，所以鏈格孢霉菌還是導致瓜果、蔬菜以及一些冷藏食品腐敗變質主要真菌。鏈格孢霉菌能產(chǎn)生許多次級代謝產(chǎn)物，其中有一些已被證實具有明顯毒性[5]，但是只有很少一部分毒素的化學結構被表征，這些毒素根據(jù)其化學結構可分為五類(見表1和圖1)。其中，AOH、AME、TeA、TEN是目前科學家們關注最多的四種毒素。

表1 鏈格孢霉毒素分類

1.1 交鏈孢酚(AOH)

AOH的外觀為無色針狀晶體，分子式為C14H10O5，摩爾質量為258.23，熔點350 ℃，密度1.56 g/cm3，與氯化物混合反應后會呈現(xiàn)紫色，經(jīng)紫外線照射后會發(fā)出藍色熒光[6]。目前發(fā)現(xiàn)AOH 具有致突變性、致癌性、基因毒性、遺傳毒性、細胞毒性、胚胎毒性，但AOH對實驗所用動物的急性毒性較低。

Celia等[7]評估了AOH引發(fā)毒性的途徑，結果顯示經(jīng)AOH處理24 h和48 h后的細胞出現(xiàn)凋亡或壞死，線粒體膜電位(Δψm)也出現(xiàn)相應變化，從而產(chǎn)生細胞毒性。Fernández等[8]也評估了AOH在人結腸腺癌(Caco-2)細胞中的細胞毒性，結果表明，AOH在最高測試濃度下對Caco-2細胞具有細胞毒性作用。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)AOH可引起細胞的致突變和轉化，還可誘導胎兒食管鱗狀細胞癌的發(fā)生。此外，有研究顯示AOH與我國某些地區(qū)食管癌高發(fā)密切相關[4]，且AOH的致癌機理與AOH的活性、癌基因的激活以及抑癌基因的變異密切相關。

Fliszár-Nyúl等[10]對AOH與牛、豬和大鼠蛋白的結合親和力進行了測試，結果表明AOH與血清蛋白有很強的相互作用，提示了這些相互作用在體內的潛在重要性。還有研究發(fā)現(xiàn)，AOH通過抑制DNA拓撲異構酶的活性來誘導細胞死亡。拓撲異構酶與DNA的超螺旋調節(jié)聯(lián)系在一起，并參與細胞的復制、轉錄和修復等，AOH由此引起單鏈 DNA 和雙鏈 DNA 的斷裂[11]。Solhaug等[12]發(fā)現(xiàn)細胞應激通常與自噬有關，因此采用RAW264.7巨噬細胞模型來驗證AOH誘導自噬的假說。透射電鏡分析表明，AOH處理的細胞不僅能清晰地顯示自噬相關的結構，如自噬體和自體溶酶體，而且還能清晰地顯示板層小體的出現(xiàn)。長期的AOH處理使細胞形態(tài)由圓形變?yōu)樾切?，?半乳糖苷酶活性增加，這表明細胞最終進入衰老。因此，這些數(shù)據(jù)表明AOH是自噬和衰老的誘導劑。且這些作用可能與AOH誘導的DSB(通過對拓撲異構酶活性的影響)有關，導致p53和Sestrin2-AMPK-mTOR-S6K信號通路的激活。

圖1 四種鏈格孢霉毒素化學結構示意圖

此外，有研究發(fā)現(xiàn)AOH 對細胞天然免疫具有調節(jié)作用，Grover等[13]研究了AOH對人支氣管上皮細胞株(Beas-2B)和小鼠巨噬細胞株(RAW 264.7)天然免疫的調節(jié)作用，在研究中發(fā)現(xiàn)AOH能抑制脂多糖(LPS)誘導的天然免疫反應。用AOH處理Beas-2B細胞會引起形態(tài)學改變，包括分離的生長模式和伸長的手臂。AOH相關免疫抑制和形態(tài)學改變與這些真菌毒素在G2/M期引起細胞周期阻滯的能力有關。

1.2 交鏈孢酚單甲醚(AME)

AME的許多性質都與AOH相似，如外觀都是無色針狀晶體，經(jīng)紫外線照射都可發(fā)出藍色熒光。AME的分子式是C15H12O5，摩爾質量為272.25，熔點 267 ℃。AME具有致畸性、致突變性、致癌性、胚胎毒性、誘變性。

有學者對AME的誘變性進行研究，如An等[14]研究發(fā)現(xiàn)，AME是大腸桿菌ND-160菌株的一種強誘變劑，而AME的致突變性表現(xiàn)出對特定基因組區(qū)域或DNA序列的選擇性。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高劑量AME喂養(yǎng)后的胎鼠會出現(xiàn)不同的癥狀，例如平均體重減輕和嚴重的器官衰竭。AME還可能引起細胞周期變化，例如動脈內出血，從而誘導癌細胞的產(chǎn)生。石智勇等[15]對食管癌高發(fā)區(qū)糧食中分離的AME在大鼠、小鼠體內的分布進行研究。實驗結果表明AME對前胃、食管下半部分有較高的親和力。

AME與其他毒素之間存在協(xié)同作用。Bensassi等[16]研究了交替醇二元混合物(AOH和AME)對人腸細胞株HCT 116細胞的作用。發(fā)現(xiàn)將HCT 116細胞暴露于低劑量的AOH或AME時，會產(chǎn)生細胞毒性，然而，當二者加在一起時，它們的毒性潛力就會大大增加。因此，該研究表明，AOH與AME的結合具有明顯的相加性。

1.3 細交鏈孢菌酮酸(TeA)

TeA是一種油狀、褐色物質，易溶于多種有機溶劑，能與許多物質發(fā)生螯合[17]。作為美國食品和藥物管理局(FDA)在有毒化學物質注冊中列出的唯一鏈格孢屬毒素，該毒素的特征是檢出率低，但產(chǎn)生毒素的能力非常強[2]。TeA具有急性及亞急性毒性、胚胎毒性、細胞毒性、致癌性以及致死性。

Yekeler等[18]研究了TeA對小鼠食管的可能毒性作用。小鼠口服TeA 10個月后，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些動物出現(xiàn)以極性喪失、核多形性和色素亢進為特征的發(fā)育不良。經(jīng)TeA處理的粘膜上皮細胞電鏡觀察顯示，部分細胞核固縮、顆?；?、染色質增多、核輪廓不規(guī)則、核質空泡化，在原子核中有明顯的多形性。綜上所述，Yekeler等認為TeA具有較高的毒性，表現(xiàn)為轉化異常。Gregory等[19]研究了AOH、AME、ALT、TeA對雞胚的影響。采用卵黃囊注射方法，對7日齡雞胚分別注射1000、500和1000 μg劑量的AOH、AME和ALT時，沒有出現(xiàn)致死率或致畸作用。而對雞胚注射548 μg劑量的TeA時，就有50%雞胚出現(xiàn)死亡，證實了TeA有致死性。除上文提到的毒性外，還有研究發(fā)現(xiàn)TeA可作為一些抑制劑。如Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)TeA是防治棉花和煙田等重要雙子葉草和單子葉雜草的一種生物除草劑。

1.4 騰毒素(TEN)

TEN表現(xiàn)為結晶狀，在有機溶劑中極易溶解，熔點為172～175 ℃[21]。TEN是環(huán)四肽類毒素，具有植物毒性，與植物萎黃病密切相關，能通過降低植物細胞內ATP酶活性來抑制光合磷酸化。值得注意的是，TEN對哺乳動物的毒性試驗目前尚未見報道。

1.5 毒理學評估

2011年，歐洲食品安全局(EFSA)應歐盟的請求，審查食品和飼料中鏈格孢霉毒素的安全性。經(jīng)研究，EFSA發(fā)現(xiàn)這些毒素一般存在于谷物和谷物制品、番茄和番茄制品、葵花籽和向日葵油、水果和水果制品以及啤酒和葡萄酒中。且鏈格孢霉毒素不僅能對許多作物造成植物疾病，其中一些毒素還能在體外和/或在大鼠體內產(chǎn)生遺傳毒性[4]。因此，EFSA采用了毒性關注閾值(TTC)方法來評估人類飲食中接觸這些毒素的相對關注程度。對于遺傳毒性毒素AOH和AME，目前人們慢性飲食接觸量已超過了相關的TTC值，需要引起人們的關注。而非遺傳毒性的TeA和TEN的飲食接觸估計值低于相關的TTC值，被認為不太可能成為人類健康的問題。同時，EFSA也對其攝入量發(fā)表了科學意見，TEN最大日攝入量閾值初步設為1500 ng/kg bw/d。我國國家風險評估中心也對鏈格孢霉毒素進行了評估，結果表明：隨膳食攝入的TeA對2～6歲兒童會存在健康威脅。然而，目前除巴伐利亞外，世界各地均無關于鏈格孢霉菌毒素的法規(guī)，我國只在出口水果蔬菜中鏈格孢菌毒素的測定中規(guī)定了其檢出限為10 μg/kg?？紤]其毒性、污染范圍、污染地域，筆者認為我國應盡快建立關于鏈格孢霉毒素的標準與法規(guī)。

2 污染現(xiàn)狀

2.1 瓜果蔬菜

大多數(shù)果蔬營養(yǎng)豐富、含水量高，故極易于被鏈格孢霉毒素感染而得病。2000年以來，全球各地均有番茄、蘋果、藍莓、葡萄、柑橘等瓜果經(jīng)報道被AOH與AME感染。而在上述提到的這些瓜果蔬菜中，最易受鏈格孢霉毒素感染的是番茄及其制品等，且TeA檢出率最高，其次是AOH和AME。

Noser等[22]研究了瑞士市場中的85種番茄產(chǎn)品，包括去皮和切碎的西紅柿，番茄湯和番茄醬以及干的和新鮮的西紅柿，發(fā)現(xiàn)有7份樣品中檢出了TeA。Sanzani等[23]對意大利南部的鮮、干番茄中交鏈孢毒素含量進行檢測，結果表明所有番茄樣品均不同程度地受到TeA的污染，其次是AME、TEN和AOH。除上述國家外，美國、巴西、阿根廷、瑞士、意大利等地的番茄中均有交鏈孢霉毒素檢出。

除番茄外，橘類也非常容易被鏈格孢霉菌感染。史文景等[24]采用UPLC-ESI-MS-MS法測定了100個柑橘樣品中的鏈格孢霉毒素，結果顯示有15%柑橘果皮樣品呈陽性，7%份全果樣品呈陽性，同時有3份果肉樣品被檢測出AME。

2.2 谷物及其制品

鏈格孢霉菌是普遍存在于各種谷物中的主要致病真菌。與果蔬相比，寄生于谷物中的鏈格孢菌株種類比較少，但其分布非常廣，遍及全球各地，德國和阿根廷等國家還曾爆發(fā)過由鏈格孢霉毒素引起的小麥黑胚病，導致小麥急劇減產(chǎn)，損失慘重，為此，歐洲長期監(jiān)測鏈格孢霉菌對小麥的危害。

Jovana等[25]首次評價了鏈格孢霉菌侵染及其毒素對小麥品質的影響。結果表明，真菌污染顯著降低了貿易和工藝質量參數(shù)。接種鏈格孢霉菌后的小麥體積重、千粒重和濕面筋含量顯著降低，蛋白質含量顯著提高。AOH對體積重和千粒重影響最大(-0.847；-0.898)，與蛋白質含量(0.758)呈極顯著正相關。鏈格孢霉菌另外還破壞了面粉面筋結構，導致面團能量降低和烘焙質量下降。

Marina等[26]研究2001年至2010年勃蘭登堡州(德國)不同地區(qū)商業(yè)農場的1064個新收獲的冬小麥樣本中的鏈格孢霉毒素含量。采用二極管陣列和熒光檢測器相結合的高效液相色譜法(HPLC)分析了AOH、AME、ALT和TeA。最常見的真菌毒素是TeA，1064份樣品中有322份(30.3%)受TeA污染，86份(8.1%)被AOH污染，33份(3.1%)被AME污染，267份(2.6%)樣品中有7份(2.6%)受ALT污染。所有年份的最高毒素含量分別為4224 μg(TeA)kg-1，832 μg(AOH)kg-1，905 μg(AME)kg-1和197 μg(ALT)kg-1。幾種真菌毒素在小麥樣品中的共現(xiàn)率較低：只有3份樣品被全部4種毒素污染，14份被3種毒素污染，61份被2種毒素污染，273份被一種毒素污染。

2.3 油料作物

油料作物是一種種子中含有大量脂肪的作物，可用于提取食用油或用作工業(yè)和醫(yī)學原料。油料作物及其產(chǎn)品(例如食用油)非常容易受到霉菌毒素的污染。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織的估計，每年全球約25%的農產(chǎn)品被霉菌毒素污染，而油料作物無論是通過淋濾還是壓榨，其中的霉菌毒素都會隨之遷移到成品油中。Kralova等[27]2002-2003年共分析了在有機和/或常規(guī)耕作條件下種植的122個亞麻和84個豌豆種子樣本。結果顯示，有20份亞麻籽中檢出AME，其中2份和4份種還分別檢出ALT(交鏈孢烯)和AOH。Hickert等[28]對來自南非不同產(chǎn)地的不同品種的向日葵種子樣品(N=80)中鏈格孢屬真菌產(chǎn)生的15種毒素進行了分析。結果顯示，超過80%的樣品對一種或多種的鏈格孢霉毒素檢測結果呈陽性，并且其中TEN的檢出率最高，為73%，其次是TeA，檢出率為51%。

3 檢測方法

3.1 高效液相色譜法

HPLC常用于真菌毒素的實驗室仲裁檢測。Andersen等[29]建立了一種利用HPLC檢測和定量檢測蘋果致病性和產(chǎn)毒鏈格孢霉菌的實時PCR方法。實驗對8株鏈格孢霉菌進行了AM-毒素I基因及其產(chǎn)物的分析。結果表明，8株菌株均含有AM毒素基因，均能產(chǎn)生植物致病性觸須毒素。Pavón 等[30]采用HPLC對樣品中α-烯、互變酚和互變酚甲醚的發(fā)生情況進行了分析，以評價PCR法鑒定含有鏈格孢霉毒素的番茄樣品的能力。PCR檢測表明有鏈格孢霉菌的存在，90份商品樣品中有41份(45.6%) DNA，而在31份PCR陽性樣品中，HPLC檢測到至少1份鏈霉菌毒素。鏈格孢霉菌DNA的檢測與所分析的鏈格孢霉毒素的存在有很好的相關性。

3.2 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法是目前鏈格孢霉毒素最常用的測定方法。Lilly等[31]建立了高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)方法，并應用穩(wěn)定同位素稀釋法進行了分析。方法檢出限(LOD)為0.86 g/kg，定量限(LOQ)為2.89 g/kg。共對德國市場的26個番茄樣品和4個鈴椒樣品進行了分析。每個樣品中均檢出TeA，其濃度范圍為2330 μg/kg～3 g/kg。Sebastian等[32]建立了穩(wěn)定同位素稀釋HPLC-MS/MS方法，對德國市場上的20種番茄產(chǎn)品進行了色譜分離，結果顯示所有產(chǎn)品均被TeA污染。Fraeyman等[33]建立了一種液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)測定豬和肉雞血漿中TeA含量的方法，并對其結果進行了驗證。相關系數(shù)、擬合優(yōu)度系數(shù)、日內和日間精度均在驗收標準之內，鏈格孢霉毒素在豬和肉雞血漿中的定量限為5.0 ng/mL。

3.3 酶聯(lián)免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay)

除了上述傳統(tǒng)的檢測方法外，使用酶聯(lián)免疫吸附法快速靈敏地檢測交鏈孢菌毒素已成為近期研究的重點。Gross等[34]以天然污染的高粱粒和高粱為原料，以穩(wěn)定的同位素稀釋LC-MS法(SIDA)為參考方法，對TeA的ELISA進行了比較分析。ELISA檢測高粱籽粒中LOD為30 μg/kg，高粱為220 μg/kg。SIDA在6～584 μg/kg(平均113 μg/kg)范圍內對茶葉的陽性率為100%(n=28)。雖然ELISA法比SIDA法靈敏度低得多，但它可以作為高粱和高粱為基礎的嬰兒食品的篩選方法。

4 結 語

鏈格孢霉菌是一種能廣泛侵染農作物、水果蔬菜的致病真菌，具有許多代謝產(chǎn)物，其中70多種被證實有明顯的毒性，如致畸性、致死性、致癌性、致突變性、細胞毒性、急性毒性、胚胎毒性等?？茖W家們主要關注的4種鏈格孢霉毒素為AOH、AME、TeA及TEN。這四種毒素常在谷物、水果、蔬菜、油料作物中被檢出，且有些檢出率極高，被污染的農作物遍布世界各地，能引起許多農作物病害。歐洲食品安全局已經(jīng)對鏈格孢霉毒素進行了評估，結果表明隨著食品攝入的AOH與AME會對人體產(chǎn)生危害，并且對TEN的攝入量進行了評估，其最大日攝入量閾值初步設為1500 ng/kg bw/d。鑒于其毒性、污染范圍及對人體的潛在危害，中國與世界各國未來應加快速度建立鏈格孢霉毒素的限量標準，從而更好地為食品安全保駕護航。