三陰性乳腺癌患者PD-1/PD-L1通路表達(dá)改變及臨床意義

苗天培，張震宇，李 中

（1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院，保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，保定 071000）

三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和Her2/neu受體均為陰性的乳腺癌，在所有乳腺癌患者中約占15%［1-2］。與普通乳腺癌相比，TNBC具有發(fā)病年齡相對較輕、腫瘤惡性程度較高以及發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性更大等特點(diǎn)，對全球婦女健康產(chǎn)生重大影響［3］。免疫靶向治療是近年來受到廣泛關(guān)注的癌癥治療方式，與放化療相比，免疫治療可針對腫瘤發(fā)生免疫逃逸的通路進(jìn)行靶向抑制，以此來抑制腫瘤生長，取得了良好的效果，美國FDA已批準(zhǔn)將T細(xì)胞的共抑制分子程序性死亡受體/配體-1（Programmed death receptor/ ligand-1，PD-1/PD-L1）抗體藥物Pembrolizumab和Nivolumab用于幾類惡性腫瘤的治療［4-5］。因此，有必要對PD-1/PD-L1在TNBC患者中的表達(dá)改變及其臨床意義進(jìn)行研究，本研究就此展開討論，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科2016年1月～2019年10月收治的三陰乳腺癌患者50例作為研究對象，患者年齡36～73歲，平均56.02±9.30歲，納入研究組，選擇同期于我院進(jìn)行治療的非三陰性乳腺癌患者55例作為對照，患者年齡27～83歲，平均年齡53.04±11.06歲，納入對照組，兩組患者在年齡、病理類型、組織學(xué)分級(jí)方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺癌及三陰性乳腺癌的診斷參照中國癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019版）》，患者均經(jīng)病理組織學(xué)確診。②入院前未經(jīng)放化療治療。③臨床資料完整。④患者對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者合并乙肝、艾滋病等嚴(yán)重傳染性疾病者。②合并除乳腺癌外導(dǎo)致患者免疫功能嚴(yán)重不全疾病者。③患者肝腎功能不全，對放化療無法耐受者。

1.2 PD-1/PD-L1在外周血及病灶組織的mRNA表達(dá)所有入選患者入院后次日清晨抽取其外周靜脈血2mL，采用淋巴細(xì)胞分離液按照步驟制備為外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞液。對醫(yī)院保存患者乳腺癌病灶組織標(biāo)本進(jìn)行收集，將血液標(biāo)本與組織標(biāo)本均采用密度梯度離心法提取其RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，試劑盒購自北京TIANGEN生化科技有限公司。采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增法（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain amplification，RT-PCR法）檢測癌組織及外周血中PD-1/PD-L1水平，所用引物序列為：PD-1：上游：5’－CGGCCAGTTCCAAACCCT－3’，下 游：5’－CCATTCCGCTAGGAAAGACA－3’。PD-L1：上游 5’-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3’，下游 5’-TGCAGC CAGGTCTAATTGTTTT-3’，所選內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，引物序列：上游5’-GTACGACTCACTATAGGGA -3’，下游5’-AACAGCGACACCCACTCCTCCA-3’，引物設(shè)計(jì)采用Prime 5.0軟件，由南京擎科生物科技有限公司合成，相對表達(dá)結(jié)果計(jì)算采用2-?ct法計(jì)算得出。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用mean±SD表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同組比較以配對t進(jìn)行，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者PD-1、PD-L1水平比較與對照組相比，研究組患者癌組織及外周血中PD-1、PD-L1水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組患者PD-1/PD-L1水平比較

2.2 轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移組患者PD-1、PD-L1水平比較共有12例三陰乳腺癌患者發(fā)生腫瘤的局部轉(zhuǎn)移，與未轉(zhuǎn)移組相比，轉(zhuǎn)移組三陰乳腺癌組患者癌組織及外周血中PD-1、PD-L1水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移組患者PD-1、PD-L1水平比較

2.3 化療前后患者PD-1、PD-L1水平比較與治療前相比，經(jīng)過放化療治療后，患者PD-1、PD-L1水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 化療前后患者PD-1、PD-L1水平比較

2.4 PD-1、PD-L1水平相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果表明，癌組織與外周血中PD-1/PD-L1水平均呈正相關(guān)關(guān)系，癌組織與外周血中PD-1、PD-L1水平與CD4+T淋巴細(xì)胞水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 PD-1、PD-L1水平相關(guān)性分析

3 討論

乳腺癌是當(dāng)今時(shí)代對女性健康危害較為嚴(yán)重的惡性疾病，發(fā)病率較高，近年來隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，該病的早期診斷及治療有了長足的進(jìn)步，但對于晚期患者來說，對身體傷害極大的放化療仍是患者進(jìn)行治療的主要手段。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)中心（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）對12000名乳腺癌患者調(diào)查結(jié)果表明，與非TNBC患者相比，TNBC患者在發(fā)現(xiàn)疾病后2年內(nèi)乳腺癌特異性生存率、總體生存率更低［7］，尋找特異性高的分子用于TNBC的治療評價(jià)及預(yù)后預(yù)測具有重要價(jià)值。PD-1是近年來免疫學(xué)界受到廣泛關(guān)注的明星分子，屬于B7H4蛋白超家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的配體包括 PD-L1 及 PD-L2［8］。既往研究［9］表明，以PD-1、CTLA-4、CD28、Tim-3、TIGIT、LAG3等為代表的共信號(hào)分子可對T細(xì)胞功能產(chǎn)生抑制，是腫瘤逃逸的關(guān)鍵機(jī)制之一，而以PD-1抗體為主的免疫靶向腫瘤治療藥物已在臨床中有所應(yīng)用［10］，然而，PD-1/PD-L1在TNBC的治療及預(yù)后方面的作用仍不明確。

目前PD-1的檢測主要有幾種方式，通過免疫組化檢測其組織中的蛋白表達(dá)、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測其在T細(xì)胞表面的表達(dá)、通過ELISA法檢測其蛋白在外周血中的表達(dá)以及通過RT-PCR檢測其在外周血或病灶組織出的mRNA水平，與其他方法相比，RT-PCR法具有檢測靈敏、成本相對較低等優(yōu)勢［11-12］。本研究通過對外周血及病灶組織處PD-1/PD-L1 mRNA水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，與非TNBC相比，TNBC組PD-1/PD-L1明顯上調(diào)，而與非轉(zhuǎn)移TNBC患者相比，發(fā)生轉(zhuǎn)移的TNBC患者PD-1/PD-L1水平更高，同時(shí)，放化療治療可明顯降低TNBC患者PD-1/PD-L1水平。此前研究［13］表明，高PD-1陽性免疫細(xì)胞浸潤與患者TNBC生存期縮短有關(guān)，而PD-1+細(xì)胞與TNBC患者高組織學(xué)分級(jí)、腫瘤分期存在聯(lián)系。RNA測序結(jié)果［14］也顯示，與非TNBC相比，TNBC患者PD-L1表達(dá)顯著增加。在國內(nèi)學(xué)者的研究中，張亞等［15］發(fā)現(xiàn) PD-1 和 PD-L1 在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后存在緊密聯(lián)系，駱麗等［16］研究表明 PD-L1及PD -1在TNBC中高表達(dá)，可以作為TNBC免疫治療的靶標(biāo)及預(yù)后標(biāo)記物，而腫瘤體積大、BLBC、Ki67 增殖指數(shù)高及高 TIL是PD-L1及PD-1 表達(dá)的危險(xiǎn)因素，此外PD-1/PD-L1表達(dá)在 TNBC中存在組織學(xué)異質(zhì)性。

本研究結(jié)果證明了三陰乳腺癌患者比普通乳腺癌患者癌組織及外周血中發(fā)生了明顯的PD-1/PD-1通路上調(diào)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、放化療治療存在聯(lián)系，因此對于臨床治療效果的判別具有一定價(jià)值，但本研究依然存在一定的缺陷，例如病例數(shù)較少、未對其預(yù)后價(jià)值進(jìn)行分析等，其機(jī)制有待深入研究。