過(guò)敏性哮喘誘導(dǎo)痰中高遷移率族蛋白B1、晚期糖基化終產(chǎn)物受體表達(dá)與血清總免疫球蛋白E 水平的相關(guān)性

馬敬斌，王道方

作者單位：聊城市第二人民醫(yī)院兒科，山東 聊城252600

過(guò)敏性哮喘是反復(fù)接觸過(guò)敏原后，產(chǎn)生主要由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的一種變態(tài)反應(yīng)性呼吸道炎性疾病，發(fā)病表現(xiàn)為咳嗽、喘鳴及呼吸困難［1-2］。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的重要細(xì)胞因子，且有組織修復(fù)的功能，許多研究表明拮抗HMGB1 活性可緩解哮喘，推測(cè)HMGB1影響哮喘慢性氣道炎癥發(fā)病過(guò)程［3-4］。晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）是HMGB1 重要受體之一，兩者結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致病理?yè)p傷發(fā)生，影響關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等炎性疾病的發(fā)病過(guò)程［5］。IgE 屬于人體五大免疫球蛋白之一，可促發(fā)、推進(jìn)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［6］。當(dāng)變應(yīng)原進(jìn)入易感者體內(nèi)，大量IgE吸附于嗜酸性粒細(xì)胞表面，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)，引起哮喘［7］。因此，檢測(cè)血清總IgE水平對(duì)于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)和過(guò)敏原的確定很有價(jià)值。但目前關(guān)于過(guò)敏性哮喘病兒誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE與血清總IgE水平相關(guān)性的研究較少。

因此，本研究通過(guò)檢測(cè)過(guò)敏性哮喘病兒誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE與血清總IgE水平，探討各指標(biāo)之間的相關(guān)性，從而為臨床上提供過(guò)敏性哮喘的診斷指標(biāo)，對(duì)評(píng)價(jià)其早期危險(xiǎn)性有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料選取 2015 年 4 月至 2018 年 9 月因過(guò)敏性哮喘于聊城市第二人民醫(yī)院免疫?？崎T診及病房接受治療的150 例病兒為研究對(duì)象，其中2例病兒誘導(dǎo)痰失敗，最后納入148例病兒（哮喘組），其中男83 例，女65 例；年齡（7.63±4.01）歲，范圍為3～12歲；同期選取136例健康體檢兒童作為對(duì)照組，其中男71例，女65例；年齡（7.72±4.23）歲，范圍為3～13 歲。兩組性別（χ2＝0.287，P＞0.05）、年齡（t＝0.184，P＞0.05）等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合過(guò)敏性哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］并排除其他呼吸系統(tǒng)疾病者；②入組前4 周無(wú)全身糖皮質(zhì)激素應(yīng)用者；③入組前1周未使用抗白三烯、抗組胺類藥物者；④年齡范圍為3～13歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有風(fēng)濕類疾病、其它心肺疾病及精神異常者；②有糖皮質(zhì)激素和β2受體激動(dòng)劑過(guò)敏史者；③入組前4 周有呼吸道感染者。本研究病人或其近親屬知情同意，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2主要試劑與儀器IgE 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒，購(gòu)自上海凱博生物科技有限公司；HMGB1 ELISA試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)180214），購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司；RAGE ELISA 試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)180425），購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司；二硫蘇糖醇（DTT）溶液，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。HB7501 型五分類全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，購(gòu)自濟(jì)南童鑫生物科技公司；CHESTAC-8900型肺功能儀，購(gòu)自北京西化儀科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 血清采集抽取兩組兒童清晨空腹靜脈血，其中一管加入乙二胺四乙酸二鉀抗凝；另一管3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。

誘導(dǎo)痰采集給予兩組兒童4.5%高滲鹽水氧化射流霧化吸入，鼻腔內(nèi)分泌物完成清除后進(jìn)行漱口、吞水，充分清潔鼻腔及口腔后，在家長(zhǎng)配合下讓兩組兒童進(jìn)行重復(fù)深咳嗽獲得至少1 g痰液，部分做中性粒細(xì)胞檢測(cè)，另一部分加入2 倍體積0.1%DTT溶液，震蕩混勻15 s，37 ℃恒溫水浴鍋中震蕩15 min，3 000 r/min 離心 15 min 后收集上清，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 ELISA 法檢測(cè)誘導(dǎo)痰中 HMGB1、RAGE 及血清總IgE水平 -80 ℃中取出誘導(dǎo)痰和血清，ELISA法檢測(cè)兩組兒童誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE及血清總IgE水平，檢測(cè)方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3 檢測(cè)肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞水平 肺功能指標(biāo)檢測(cè)采用肺功能儀檢測(cè)兩組兒童的肺通氣功能，主要檢測(cè)指標(biāo)：第一秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）、最大呼氣峰流速（PEF）。誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞水平檢測(cè)誘導(dǎo)痰采集后不經(jīng)稀釋處理制成痰標(biāo)本，痰涂片可見(jiàn)較多柱狀上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞且鱗片上皮細(xì)胞占有核細(xì)胞比例＜0.2 的標(biāo)本為合格。選取少量痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，風(fēng)干后做瑞氏染色，顯微鏡進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞百分比。血清嗜酸粒細(xì)胞檢測(cè)取抗凝處理的血，使用五分類全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，計(jì)算嗜酸粒細(xì)胞百分比。

表2 過(guò)敏性哮喘病兒148例與健康兒童136例肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞水平比較/（%，xˉ±s）

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)；采用Pearson法分析兩組HMGB1、RAGE、IgE與肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞相關(guān)性，分析哮喘組HMGB1、RAGE與IgE水平相關(guān)性。logistic 回歸分析影響過(guò)敏性哮喘的因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE表達(dá)及血清總IgE水平比較哮喘組誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE 表達(dá)及血清總IgE 水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 過(guò)敏性哮喘病兒148例與健康兒童136例誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE表達(dá)及血清總IgE水平比較/xˉ±s

2.2兩組肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞水平比較哮喘組FEV1、FVC、PEF水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3過(guò)敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE與肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞水平相關(guān)性Pearson法分析結(jié)果顯示，兩組HMGB1、RAGE、IgE 與FEV1、FVC、PEF 水平均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。與中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞水平均呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4過(guò)敏性哮喘病兒誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE表達(dá)與血清總IgE水平相關(guān)性Pearson 法分析結(jié)果顯示，過(guò)敏性哮喘病兒誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE 表達(dá)與血清總IgE 水平均呈現(xiàn)正相關(guān)（r＝0.454、0.522，均P＜0.05）。

2.5影響過(guò)敏性哮喘的多因素分析將是否發(fā)生過(guò)敏性哮喘為因變量，以HMGB1、RAGE、IgE等為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic 回歸分析，結(jié)果顯示HMGB1、RAGE、IgE、嗜酸性粒細(xì)胞是影響過(guò)敏性哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表4。

表3 過(guò)敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE水平與肺功能指標(biāo)、粒細(xì)胞水平相關(guān)性

表4 影響過(guò)敏性哮喘的多因素分析

3 討論

兒童過(guò)敏性哮喘長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作可并發(fā)慢性支氣管炎、肺間質(zhì)纖維化等［9-10］。過(guò)敏性哮喘病人發(fā)病機(jī)制主要是其體內(nèi)存在多種細(xì)菌、病毒的特異性IgE，吸入相應(yīng)抗原時(shí)即可激發(fā)哮喘［11］。

HMGB1是一種晚期炎癥介質(zhì)，廣泛分布于細(xì)胞核內(nèi)外，能參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、刺激促炎因子產(chǎn)生、促進(jìn)炎癥細(xì)胞活化，目前已被證實(shí)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭等多種疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用［12-13］。RAGE 是 HMGB1 受體之一，與HMGB1結(jié)合后可趨化炎癥細(xì)胞募集［14］。吳小進(jìn)等［15］表明HMGB1能劑量依賴性誘導(dǎo)RAGE蛋白的表達(dá)，支氣管上皮細(xì)胞中HMGB1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通過(guò)RAGE/c-Jun氨基端激酶（JNK）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路介導(dǎo)。本研究提示過(guò)敏性哮喘病兒誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE 表達(dá)水平高于健康兒童，分析HMGB1、RAGE 結(jié)合后，觸發(fā)信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κB活化，促使炎癥反應(yīng)進(jìn)行，參與過(guò)敏性哮喘發(fā)生過(guò)程。

IgE是人體五大免疫球蛋白之一，正常情況下IgE低表達(dá)［16］。陳丹君等［17］指出哮喘病兒血清中25-羥維生素D3水平降低，IgE水平增加，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究提示過(guò)敏性哮喘病兒血清中總IgE水平高于健康兒童，分析機(jī)體內(nèi)B淋巴細(xì)胞合成IgE后，激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞，釋放炎性介質(zhì)使病人出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、引起平滑肌收縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張，最終導(dǎo)致哮喘。

FEV1 及PEF 是檢測(cè)大小氣道氣流受限的肺功能常用指標(biāo)，能反映大氣道的阻塞情況［18］。嗜酸粒細(xì)胞釋放多種蛋白造成氣道上皮細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致哮喘。許多研究發(fā)現(xiàn)部分重癥哮喘或難治性哮喘病人表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞性氣道炎癥，中性粒細(xì)胞與炎癥介質(zhì)共同作用影響哮喘的發(fā)生［19］。本研究提示過(guò)敏性哮喘病兒FEV1、FVC、PEF 水平低于健康兒童，中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞水平高于正常兒童，過(guò)敏性哮喘病兒肺功能受損。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘病兒HMGB1、RAGE、IgE 與FEV1、FVC、PEF 水平均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞水平均呈現(xiàn)正相關(guān)；且誘導(dǎo)痰中HMGB1、RAGE 表達(dá)與血清總IgE 水平均呈現(xiàn)正相關(guān)。logistic 回歸分析結(jié)果顯示HMGB1、RAGE、IgE、嗜酸性粒細(xì)胞是影響過(guò)敏性哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素。提示 HMGB1、RAGE、IgE 可能與FEV1、FVC、PEF、粒細(xì)胞共同作用，影響過(guò)敏性哮喘發(fā)生。進(jìn)一步提示臨床上應(yīng)密切關(guān)注各指標(biāo)水平的變化，尤其是HMGB1、RAGE、IgE、中性粒細(xì)胞，及時(shí)預(yù)防和治療。