多功能蛋白聚糖在胃癌中的表達(dá)及其臨床預(yù)后

張捷，龔慶豪，章波，朱松明

作者單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院普外科，上海202150

胃癌是全世界最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國，胃癌的病死率位列惡性腫瘤的第2 位，嚴(yán)重危害我國人民群眾的生命健康，胃癌的診療任重而道遠(yuǎn)［1-2］。盡管手術(shù)、放療、化療以及靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用延長了胃癌病人的生存時間，但其發(fā)病發(fā)展機(jī)制尚未完全闡明，沒有有效地預(yù)測診療的標(biāo)志物和分子靶點，胃癌病人的預(yù)后依然不理想［3］。因此，從分子水平探討胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找治療藥物作用的關(guān)鍵靶點，對于延長胃癌病人的生存時間意義重大。

多功能蛋白聚糖（Versican，VCAN）基因?qū)儆诘鞍拙厶羌易?，一種硫酸軟骨素蛋白多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是為哺乳動物細(xì)胞外基質(zhì)中最為豐富的蛋白聚糖，在組織形態(tài)形成和維持中起著重要作用，VCAN 蛋白通過與多種蛋白分子相互作用，在發(fā)育和疾病早期形成的臨時基質(zhì)中富集，參與細(xì)胞分類、黏附、增殖、遷移和血管生成［4-6］。VCAN 在多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，并且與癌癥復(fù)發(fā)及生存預(yù)后不良關(guān)系密切［7］。有研究報道VCAN 在胃癌中高表達(dá)，VCAN 高表達(dá)與胃癌病人的生存相關(guān)，VCAN 可能是胃癌病人生存的重要的預(yù)后標(biāo)志物［8-9］，但目前VCAN 在胃癌中的表達(dá)及作用尚未完全闡明。本研究于2019 年7—9 月通過檢索癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），Oncomine 和 Kaplan-Meier Plotter 等大型開放性癌癥公共數(shù)據(jù)庫中胃癌組織VCAN 的基因組表達(dá)及臨床數(shù)據(jù)，對VCAN 在胃癌中的表達(dá)水平及其臨床預(yù)后意義和可能參與的信號通路進(jìn)行了深度挖掘分析。

1 資料與方法

1.1 TCGA胃癌數(shù)據(jù)下載與整理從TCGA 官方網(wǎng)站（http：//www.tcga.org）基因組數(shù)據(jù)共享（Genomic Data Commons，GDC，https：//portal. gdc. cancer.gov/）鏈接中下載胃癌轉(zhuǎn)錄組及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，包括 407 個文件和 380 個病例，使用 R 及 perl 軟件整理合并數(shù)據(jù)文件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM 3級）包括375 例胃癌組織和32 例癌旁正常組織樣本，用于VCAN mRNA 差異表達(dá)分析。篩選出368例生存信息完整的胃癌病人數(shù)據(jù)用于臨床相關(guān)性和生存分析，全組胃癌病人的一般資料情況詳見表l。

1.2 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析VCAN表達(dá)水平使用Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https：//www.oncomine.org/）分析VCAN mRNA 在胃癌和正常胃組織中的表達(dá)差異。設(shè)置篩選數(shù)據(jù)的參數(shù)如下：（1）Gene：VCAN；（2）Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis；（3）Data Type：mRNA；（4）Cancer Type：Gastric Cancer；（5）Threshold by：P value＜1E-4，foldchange＞2，gene rank＝top10%。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析使用Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫（https：//kmplot.com/analysis/）分析VCAN mRNA的表達(dá)與胃癌病人生存時間的關(guān)系。設(shè)置篩選數(shù)據(jù)的參數(shù)如下：（1）Gene：VCAN；（2）Split patients by：media；（3）Survival：OS（n＝882）；（4）Probe set options：only JetSet best probe set；（5）Array quality control：exclude biased arrays（n＝1 060）。

1.4基因集富集分析采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）軟件（3.0 版）進(jìn)行分析。以中位數(shù)為界將VCAN mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組及低表達(dá)組。利用GSEA 網(wǎng)站中獲得的c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt 規(guī)范化信號通路進(jìn)行富集分析。按缺省加權(quán)富集統(tǒng)計的方法進(jìn)行富集分析，設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000 次。將錯誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rates，F(xiàn)DR）＜0.25 定義為顯著富集。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法根據(jù)胃癌組織中VCAN mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將全組病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Graphpad prim 7 進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果的可視化。VCAN mRNA表達(dá)水平的兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用Dunnett-t檢驗）。VCAN mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)（年齡、性別、病理分級、TNM分期、T分期、N分期和M分期）相關(guān)性分析采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 法，應(yīng)用log-rank 檢驗生存差異，單因素和多因素分析采用Cox回歸模型，Cox多因素分析采用Wald 檢驗輸入法。采用自適應(yīng)線性向上控制方法（a-daptive linear step-up，ALSU）計算FDR。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VCAN在胃癌癌和正常胃組織差異表達(dá)對TCGA 數(shù)據(jù)庫中VCAN 在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：VCAN mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平（15.138±0.654）明顯高于正常胃組織（3.678±0.346），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝5.103，P＜0.001），見圖1A。將27 例胃癌和相配對的非腫瘤胃組織進(jìn)行配對t檢驗［（3.534±0.402）比（9.833±1.411），t＝4.931，P＜0.001］結(jié)果顯示VCAN mRNA在胃癌組織中的表達(dá)顯著增多，見圖1B。進(jìn)一步在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中分析VCAN mRNA 在胃癌組織及正常胃組織中的表達(dá)差異，結(jié)果如圖1C～1F所示，VCAN 表達(dá)水平在胃癌中均顯著升高（P＜0.05）。

2.2 VCAN差異表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性TCGA 數(shù)據(jù)庫中VCAN 差異表達(dá)亞組分析結(jié)果表明，I-IV 期病人胃癌組織VCAN 表達(dá)分別為（10.40± 9.63）、（14.76±11.69）、（15.29±11.99）和（16.94±15.04），T1-T4 病人胃癌組織VCAN 表達(dá)分別為（4.428±4.112）、（14.377±12.016）、（15.036±12.644）和（16.282±12.125），病理分級G1-2 和G3 病人胃癌組織VCAN 表達(dá)分別為（12.864±11.613）和（16.428±12.984），在胃癌的不同 TNM 分期（F＝3.192，P＝0.038）、T 分期（F＝4.703，P＝0.003）及病理分級（t＝2.642，P＝0.008）中VCAN表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，整體趨勢為TNM分期、T分期及病理分級越高，VCAN 表達(dá)水平越高，見圖2。進(jìn)一步以中位值為界限將368例胃癌病人分為VCAN高表達(dá)組和低表達(dá)組各184 例，分析胃癌病人VCAN mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，如表1 示，VCAN mRNA表達(dá)與T 分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、性別、病理分級、TNM分期、N分期和M分期無關(guān)（P＞0.05）。

2.3 VCAN的表達(dá)與胃癌病人預(yù)后的相關(guān)性TCGA 中胃癌病人生存分析結(jié)果表明VCAN mRNA 高表達(dá)病人與低表達(dá)病人相比生存率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.015），圖3A。采用Kaplan-Meier Plotter 在線生存分析數(shù)據(jù)庫對TCGA 生存分析結(jié)果進(jìn)行驗證，全組胃癌病人中VCAN mRNA 高表達(dá)組生存率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.003），圖3B；亞組分析結(jié)果表明I 期（P＝0.008，圖3C）、III 期（P＝0.01，圖3E）和IV期（P＝0.003，圖3F）胃癌病人中VCAN mRNA高表達(dá)組生存率也明顯低于低表達(dá)組，而II期（P＝0.12，圖3D）病人兩組生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 多功能蛋白聚糖（VCAN）基因在胃癌組織及正常胃組織之間的表達(dá)差異：A為癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中VCAN mRNA在胃癌及正常胃組織中的表達(dá)水平；B為TCGA數(shù)據(jù)庫中VCAN mRNA在配對癌及癌旁正常組織中的表達(dá)水平；C～F為Oncomine數(shù)據(jù)庫中4項關(guān)于VCAN在胃癌組織及正常胃組織之間的表達(dá)差異（Chen、Cui、DErrico、Wang的胃癌數(shù)據(jù)）

表1 多功能蛋白聚糖（VCAN）mRNA表達(dá)水平與胃癌病人臨床病理特征的相關(guān)性/例

采用單因素和多因素Cox 回歸分析TCGA 胃癌數(shù)據(jù)（表2），其中單因素分析結(jié)果表明，年齡、TNM分期、T分期、N分期、M分期及VCAN表達(dá)與胃癌病人的不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。多因素分析結(jié)果表明，VCAN 表達(dá)和年齡可能是胃癌病人不良預(yù)后的獨立風(fēng)險因素（P＝0.006）。

2.4基因富集分析預(yù)測VCAN的功能GSEA 富集分析共篩選出與VCAN 高表達(dá)相關(guān)的85 個FDR＜0.25的基因集，72個P＜0.05的基因集，進(jìn)一步結(jié)合既往對胃癌研究的靶點基因，選取有意義的信號通路，結(jié)果如圖4所示，VCAN 高表達(dá)主要富集在腫瘤（FDR＜0.001，P＜0.001），絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路（FDR＜0.001，P＜0.001），Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號通路（FDR＜0.001，P＝0.002），Wnt 信號通路（FDR＝0.001，P＜0.001），Toll 樣受體信號通路（FDR＝0.003，P＝0.004），哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路（FDR＝0.008，P＝0.004）等信號通路。

3 討論

既往相關(guān)研究表明，VCAN 在腎癌［10］、肝細(xì)胞癌［11-12］、結(jié)直腸癌［13-14］、膽管癌［15］、子宮內(nèi)膜癌［16］和胃癌［8-9］等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，VCAN 高表達(dá)與腫瘤的高分期、低分化、高轉(zhuǎn)移率及不良預(yù)后正相關(guān)。VCAN主要由基質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞可以合成并分泌，腫瘤的進(jìn)展也與細(xì)胞外基質(zhì)的擴(kuò)張和腫瘤間質(zhì)內(nèi)非惡性細(xì)胞的活化有關(guān)，與腺瘤相比，結(jié)腸癌中的糖蛋白VCAN 在mRNA 水平上過度表達(dá)，并與腫瘤間質(zhì)形成相關(guān)［14］，間質(zhì)VCAN表達(dá)可作為Ⅱ-Ⅲ期結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。VCAN在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，且多種腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平差異較大，VCAN 片段獨特地定位于腫瘤血管內(nèi)皮，對腫瘤生長和血管生成具有潛在的促進(jìn)作用［17］。間質(zhì)VCAN表達(dá)與晚期乳腺癌中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的積累、原發(fā)腫瘤的促炎和促血管生成狀態(tài)有關(guān)，VCAN 可促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)數(shù)量的增加［18］。VCAN 表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)包括肝細(xì)胞癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，VCAN 外顯子區(qū)基因變異可預(yù)測早期乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌切除病人的生存時間［12］。卵巢癌中FOXA2 和VCAN mRNA 水平呈負(fù)相關(guān)，miR-590-3p 通過一種新的FOXA2-VCAN 通路促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展［19］。VCAN作為骨髓微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的主要成分在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生存、增殖、遷移及耐藥中均具有重要作用，并且影響疾病的臨床表現(xiàn)及預(yù)后［7，20］。

表2 影響胃癌病人預(yù)后參數(shù)的單因素和多因素分析

Jiang 等［8］學(xué)者采用生物信息學(xué)方法挖掘胃癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VCAN 在胃癌組織中顯著高表達(dá)，VCAN 作為蛋白網(wǎng)絡(luò)互作中的關(guān)鍵樞紐基因與胃癌病人的生存期和無進(jìn)展生存期關(guān)系密切，VCAN 高表達(dá)病人預(yù)后欠佳。Sanei 等［9］利用免疫組化實驗對80 例胃腺癌病人胃切除術(shù)后的病理資料分析發(fā)現(xiàn)，胃癌上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中VCAN蛋白陽性表達(dá)分別占39.5%和22.4%，胃上皮腫瘤細(xì)胞中VCAN 蛋白的表達(dá)主要集中在胃體部（50.0%），而間質(zhì)腫瘤細(xì)胞中VCAN蛋白主要集中在胃竇部（41.2%），生存分析發(fā)現(xiàn)胃癌上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的VCAN 蛋白高表達(dá)的病人預(yù)后較差，但該研究病例數(shù)較少，沒有對VCAN 蛋白表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性進(jìn)行分析，關(guān)于VCAN 在胃癌中的具體作用及潛在分子功能尚不清楚。與上述研究結(jié)果一致，本研究利用TCGA 和Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析VCAN 在胃癌和癌旁正常胃組織中的差異表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)VCAN 在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織，VCAN表達(dá)水平與TNM分期、T分期及病理分級相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，VCAN表達(dá)越高。進(jìn)一步結(jié)合Kaplan-Meier Plotter 生存數(shù)據(jù)庫分析VCAN 的表達(dá)對胃癌病人生存預(yù)后的影響，結(jié)果提示VCAN 高表達(dá)病人預(yù)后不良，Cox 單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，VCAN 表達(dá)與是影響胃癌病人預(yù)后的獨立因素。

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)在VCAN 高表達(dá)的胃癌病人中存在 MAPK，JAK-STAT，Wnt，Toll 樣受體，mTOR 等腫瘤相關(guān)信號通路的富集，上述結(jié)果提示VCAN 可能是胃癌靶向治療新的作用靶點，該結(jié)果為進(jìn)一步實驗驗證VCAN參與調(diào)控胃癌生物學(xué)功能的分子機(jī)制提供了一定的線索。既往Tang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中VCAN可以通過激活Toll樣受體抑制樹突狀細(xì)胞的功能，從而誘導(dǎo)免疫抑制或者免疫缺陷。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路與多種癌細(xì)胞的分化、增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中可通過激活β-catenin介導(dǎo)VCAN的轉(zhuǎn)錄［22］。

由于本研究是采用多種癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)庫對VCAN在胃癌中的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行了初步的探討，結(jié)果提示VCAN在胃癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與胃癌病人的臨床病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)，也是影響胃癌病人預(yù)后的獨立危險因素，VCAN 可能通過調(diào)節(jié)Wnt、Toll樣受體等信號通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，VCAN可能是胃癌靶向治療新的作用靶點。在后續(xù)研究中，將收集相關(guān)臨床資料對上述結(jié)果予以驗證，并進(jìn)一步通過細(xì)胞和動物實驗深入探討VCAN在胃癌中的功能和作用機(jī)制。

（本文圖3，4見插圖9-5）

圖3 Kaplan-Meier分析多功能蛋白聚糖（VCAN）表達(dá)與胃癌病人總生存期的關(guān)系：A為癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中VCAN表達(dá)與胃癌病人生存期的關(guān)系；B～F為Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中不同TNM分期胃癌病人VCAN表達(dá)與生存期的關(guān)系

圖4 多功能蛋白聚糖（VCAN）在胃癌中的相關(guān)通路：A為腫瘤信號通路；B為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路；C為Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）信號通路；D為Wnt信號通路；E為Toll樣受體信號通路；F為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路