表沒食子兒茶素沒食子酸酯促進(jìn)2 型糖尿病傷口愈合的實(shí)驗(yàn)研究

張彥，汪天賜，蔡婧，李亞娟

作者單位：1空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，陜西 西安710032；2空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系，陜西 西安710032

2型糖尿病是最常見的慢性老年性疾病之一，占糖尿病病人總?cè)丝诘木懦梢陨稀ｋS著全世界老齡化問題的日益嚴(yán)峻，2 型糖尿病病人數(shù)量也在逐年上升［1-2］。2型糖尿病會(huì)累積機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生慢性并發(fā)癥，而其自身的創(chuàng)傷修復(fù)困難問題也是長期困擾醫(yī)務(wù)人員的一個(gè)重要難題，嚴(yán)重威脅著病人的生理和心理健康［3］。機(jī)體系統(tǒng)代謝紊亂、自身免疫力下降、創(chuàng)傷部位細(xì)菌繁殖、加劇的炎癥反應(yīng)等都是誘發(fā)2型糖尿病創(chuàng)傷愈合困難的關(guān)鍵因素［4-5］。目前臨床上應(yīng)對(duì)2型糖尿病創(chuàng)傷愈合問題仍以控制血糖為主要手段，但是仍缺乏有效且安全的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶茶多酚中的核心化學(xué)成分，其抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功效已得到大量的動(dòng)物和臨床研究證實(shí)［6-9］。近年來的研究也發(fā)現(xiàn)，EGCG 能夠憑借其顯著的抗炎癥反應(yīng)功效，在促進(jìn)正常和1型糖尿病軟組織創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要作用［10-12］。但是，EGCG能否顯著改善發(fā)病人群更廣泛的糖尿病類型——2型糖尿病的創(chuàng)傷修復(fù)困難問題，迄今仍未有研究記載。本實(shí)驗(yàn)于2015年1月至2016年1月通過應(yīng)用瘦素受體缺陷的2型糖尿病db/db小鼠作為動(dòng)物模型，系統(tǒng)評(píng)價(jià)EGCG對(duì)于2型糖尿病傷口愈合的治療效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備2 型糖尿病db/db 小鼠 32 只［BKS.Cg-m+/+Leprdb/J，3 月齡，雄性，無特定病原體（SPF）級(jí)，體質(zhì)量（41.50±7.95）g］，以及與它們相同背景的雄性野生型小鼠16只，體質(zhì)量（19.72±2.85）g，全部購于南京生物醫(yī)藥研究院（協(xié)議許可編號(hào)：NBRI［2014］314），醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）20120001；EGCG，購于美國Sigma 公司；麻醉藥戊巴比妥鈉緩沖液，購于美國Sigma-Aldrich 公司；血糖測試儀，購于美國Johnson&Johnson公司；3M Tegaderm透明薄膜敷貼，購于美國3M Healthcare 公司；伺服式生物力學(xué)萬能材料測試機(jī)，購于東莞市昆侖檢測儀器公司；用于拍攝傷口圖像的照相機(jī)，購于日本Canon公司；小鼠軟組織酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，購于武漢華美生物公司；激光多普勒血流測量系統(tǒng)以及與其配套的皮膚接觸探頭，購于英國Moor Instruments公司。

1.2背部軟組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建及EGCG治療本研究獲空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（許可編號(hào)：20140209），所有涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作步驟與實(shí)驗(yàn)流程均按照協(xié)議規(guī)定嚴(yán)格執(zhí)行。所有小鼠抵達(dá)本實(shí)驗(yàn)室后，適應(yīng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。1周后，于上午（8～10時(shí)）對(duì)全部小鼠進(jìn)行尾部提取靜脈血，使用血糖測試儀測量隨機(jī)血糖水平，血糖水平＞16.7 mmol/L的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物認(rèn)定模型達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，即被納入實(shí)驗(yàn)。本研究被劃分為野生型小鼠組（Control）、db/db 小鼠組（db/db）及 db/db 施以 EGCG 治療組（db/db+EGCG）共三組，每組動(dòng)物樣本量n＝16。在全部48 只小鼠的背部手術(shù)創(chuàng)建一處皮膚損傷模型，主要操作流程包括：以戊巴比妥鈉腹腔注射的形式對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行麻醉，通過應(yīng)用皮膚活檢針在所有小鼠的背部構(gòu)建1 個(gè)直徑為1 cm 的圓形傷口，確保與皮膚、真皮和肌膜充分剝離，并覆蓋以3M薄膜敷貼。隨后皮下注射青/鏈霉素預(yù)防潛在的創(chuàng)傷感染。分別在術(shù)后第5、12、19天對(duì)每組4只動(dòng)物施以過量戊巴比妥鈉安樂死，對(duì)于每組余下4 只動(dòng)物用于定量評(píng)價(jià)傷口完全愈合所花費(fèi)的時(shí)長。db/db+EGCG組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在組織損傷模型建立后立即予以每日的EGCG（10 mg/kg）灌胃處理。

1.3小鼠傷口組織局部血流速率的測試分析于軟組織創(chuàng)傷模型構(gòu)建的第5、12、19 天，通過應(yīng)用激光多普勒血流測量系統(tǒng)對(duì)小鼠背部傷口位置的局部血流速率進(jìn)行定量測試分析。主要測量步驟為：將激光多普勒測量儀的探頭放置于小鼠傷口的正中央位置，探頭由激光發(fā)射器經(jīng)發(fā)生纖維將激光束（780 nm波長）照射至傷口位置，通過探頭內(nèi)的接收纖維陣列將光信號(hào)以40 Hz的采樣速率采集傳遞至多普勒的信號(hào)處理系統(tǒng)中，最后經(jīng)自動(dòng)的數(shù)據(jù)處理獲得小鼠傷口位置的最終局部血流速數(shù)值。

1.4小鼠軟組織傷口愈合率的測試評(píng)估于軟組織創(chuàng)傷建立的術(shù)后0、5、12、19天進(jìn)行背部軟組織創(chuàng)傷的圖像采集。主要步驟包括：將戊巴比妥鈉麻醉的動(dòng)物固定在解剖手術(shù)臺(tái)上，確保動(dòng)物無任何微移動(dòng)，數(shù)碼相機(jī)通過三腳架精確固定在小鼠背部傷口位置正上20 cm，待視野充分穩(wěn)定后進(jìn)行圖像采集。使用自行編寫的Matlab 軟件程序?qū)D像中的創(chuàng)傷區(qū)域進(jìn)行圖像處理與分析（包括顏色閾值分割算法、局部自適應(yīng)邊緣提取算法等）。待軟件分析完畢后，獲得創(chuàng)傷位置的面積數(shù)值，通過公式計(jì)算傷口愈合率，作為評(píng)價(jià)軟組織愈合進(jìn)度的標(biāo)尺：傷口愈合率＝（第0 天傷口面積-第n天傷口面積）/第0天傷口面積×100%。

1.5小鼠創(chuàng)傷組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的測試評(píng)估待傷口愈合率測試完畢后，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的小鼠背部軟組織進(jìn)行取材分離，使用手術(shù)剪將皮膚軟組織生物標(biāo)本修剪為8 mm2×8 mm2的正方形狀，隨后迅速浸泡于0.9%氯化鈉溶液平衡緩沖液中以避免組織干燥。使用伺服式生物力學(xué)萬能材料測試機(jī)對(duì)軟組織進(jìn)行力學(xué)拉伸測試，主要步驟為：力學(xué)測試機(jī)的兩個(gè)預(yù)制夾具將軟組織標(biāo)本夾緊，確保傷口與夾具水平對(duì)稱，施加1 N的力預(yù)加載將樣本拉緊，待穩(wěn)定后以20 mm/min的位移速度反向移動(dòng)兩個(gè)夾具，從而在組織標(biāo)本產(chǎn)生軸向拉神應(yīng)力載荷，系統(tǒng)自動(dòng)記錄應(yīng)力與位移的時(shí)間變化關(guān)系，獲取組織標(biāo)本發(fā)生完全破裂時(shí)的斷裂載荷作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.6小鼠傷口組織的ELISA測試評(píng)估力學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠創(chuàng)傷位置余下的組織樣本用作ELISA測試。使用武漢華美生物公司的小鼠ELISA檢測試劑盒對(duì)軟組織中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)進(jìn)行測試（貨號(hào)分別為CSB-E08054m、CSB-E04639m、CSB-E04741m 和CSB-E04756m）。所有實(shí)驗(yàn)操作步驟均按照試劑盒的說明執(zhí)行。ELISA 檢測基于雙抗體夾心法原理，整個(gè)過程包括酶標(biāo)板包被、血清樣本上樣、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液顯色、終止反應(yīng)以及酶標(biāo)儀吸光度檢測，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取測量平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以xˉ±s表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測應(yīng)用SPSS 22.0 軟件。使用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni 校正法分析來進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的每兩組之間的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠血糖和體質(zhì)量的影響如圖1A所示，三組小鼠體質(zhì)量比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為78.677、55.069 和 23.499，P值均小于 0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的體質(zhì)量值分別為（42.5±4.7）g、（44.6±5.5）g 及（45.1±6.1）g，而Control組小鼠體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)分別為（20.3±2.5）g、（21.2±1.9）g及（22.6±2.3）g，db/db組顯著高于Control 組小鼠（P＜0.01），而db/db+EGCG 組小鼠的體質(zhì)量值在第 5、12、19 天分別為（43.6±7.1）g、（45.5±6.9）g及（47.1±7.2）g，均顯著高于Control組（P＜0.01），但是與db/db 小鼠的體質(zhì)量值在各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

如圖1B所示，三組小鼠血糖比較的單因素方差分析在術(shù)后的第 5、12、19 天的F值分別為 80.251、59.812和29.918，P值均小于0.001。db/db小鼠在軟組織傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的隨機(jī)血糖值分別為（21.5±2.6）mmol/L、（19.8±2.1）mmol/L 及（20.6±2.7）mmol/L，而Control 組小鼠體質(zhì)量在各時(shí)間點(diǎn)分別為（6.1±0.9）mmol/L、（5.4±0.7）mmol/L及（5.7±0.9）mmol/L，db/db組顯著高于Control組小鼠（P＜0.01）。db/db+EGCG 組小鼠的體質(zhì)量值在第 5、12、19 天分別為（23.1±3.5）mmol/L、（22.4±3.9）mmol/L 及（22.5±3.8）mmol/L，均顯著高于Control組（P＜0.01）。但是db/db 組與db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的血糖值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠組內(nèi)在術(shù)后第 5、12、19 天的體質(zhì)量和血糖均未發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），表明各組小鼠的體質(zhì)量和血糖因素在術(shù)后19 天內(nèi)并未發(fā)生明顯改變。

圖1 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠體質(zhì)量（A）和血糖（B）的影響

圖2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合速率（A）和總愈合時(shí)間（B）的影響

2.2 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口愈合率和總愈合時(shí)間的影響三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19 天的傷口愈合率的比較結(jié)果如圖2A所示。三組間傷口愈合率比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為20.953、20.788和22.543，P值均小于0.001。db/db小鼠在術(shù)后的第5、12、19 天的傷口愈合率分別為（10.1±2.0）%、（39.1±5.2）%及（59.2±6.2）%，均顯著低于Control 組在各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合率，分別為（22.1±3.0）%、（60.3±4.5）%及（85.4±5.9）%，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001；而db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后的第5、12、19天的傷口愈合率均顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的db/db 小鼠［（19.4±3.2）%比（10.1±2.0）%，P＝0.003；（55.2±4.8）%比（39.1±5.2）%，P＝0.003；（79.7±5.2）%比（59.2±6.2）%，P＝0.002］。本研究也發(fā)現(xiàn)，db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合率與Control 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.583、0.523 和0.603）。三組小鼠總愈合時(shí)間的對(duì)比結(jié)果如圖2B 所示。三組間傷口愈合時(shí)間比較的單因素方差分析的F值為14.153、P值為0.002。與Control組小鼠相比，db/db組小鼠的傷口總愈合時(shí)間顯著延長，（39.9±5.4）d 比（22.9±4.3）d，P＝0.003；而db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時(shí)間顯著低于db/db 組小鼠，（25.1±4.9）d 比（39.9±5.4）d，P＝0.006。本研究也發(fā)現(xiàn)，db/db+EGCG 組小鼠的傷口愈合時(shí)間與Control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.999）。

2.3 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19 天的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的比較結(jié)果如圖3 所示。三組間傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19天的F值分別為25.885、16.801 和 20.322，P值均小于 0.001。db/db小鼠的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度在術(shù)后的第5、12、19 天均顯著低于空白對(duì)照的Control 組，分別為（4.5±0.9）kg/mm2比（9.5±1.1）kg/mm2；（7.8±1.0）kg/mm2比（12.2 ± 2.0）kg/mm2；（10.2 ± 1.5）kg/mm2比（18.3±2.1）kg/mm2，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001；但是，db/db+EGCG組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度均顯著高于db/db 組小鼠，分別為（8.0±1.0）kg/mm2比（4.5±0.9）kg/mm2，P＝0.003；（12.2±1.7）kg/mm2比（7.8±1.0）kg/mm2，P＝0.009；（16.2±2.0）kg/mm2比（10.2±1.5）kg/mm2，P＝0.004。本研究也發(fā)現(xiàn)，db/db+EGCG組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度與Control 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.179、0.300和0.458）。

圖3 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織生物力學(xué)抗張強(qiáng)度的影響

圖4 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速度的影響

2.4 EGCG對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織位置局部血流速率的影響Control、db/db、db/db+EGCG 三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第 5、12、19 天的傷口組織位置局部血流速率的比較結(jié)果如圖4 所示。三組間傷口組織局部血流速率比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為19.786、69.561 和 38.748，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率分別為（0.51±0.08）、（0.39±0.12）和（0.49±0.13），而Control組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織位置局部血流速率分別為（1.00±0.12）、（1.35±0.11）和（1.24±0.13），db/db組均顯著低于Control組，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)P值均小于0.001；而db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后的第5、12、19天的傷口組織位置局部血流速率均顯著高于db/db組小鼠［（0.78±0.12）比（0.51±0.08），P＝0.020；（1.08±0.13）比（0.39±0.12），P＝0.001；（1.01±0.11）比（0.49±0.13），P＝0.001］。本研究也發(fā)現(xiàn)，db/db+EGCG 組小鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的傷口組織位置局部血流速率也顯著低于Control 組（P值分別為0.047、0.036和0.048）。

2.5 EGCG對(duì)于db/db小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響三組小鼠在傷口模型構(gòu)建的第5、12、19天的傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的比較結(jié)果如圖5 所示。三組間IL-1β 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為21.145、59.281 和 23.162，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19 天的傷口組織IL-1β 表達(dá)量分別為（205.4±15.4）pg/mL、（271.4±26.3）pg/mL 和（187.5±18.2）pg/mL，而db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn) IL-1β 表達(dá)量分別為（162.1±15.5）pg/mL、（200.8±20.2）pg/mL和（139.2±17.8）pg/mL，均顯著低于db/db組（P＜0.01）。三組間IL-6比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為23.295、66.094 和 26.108，P值均小于 0.001。db/db小鼠在術(shù)后第5、12、19 天的傷口組織IL-6 表達(dá)量分別為（244.4±18.3）pg/mL、（322.9±31.3）pg/mL 和（233.2±21.7）pg/mL，而db/db+EGCG 組在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn) IL-6 表達(dá)量分別為（181.2±18.2）pg/mL、（235.3±19.2）pg/mL 和（159.2±17.5）pg/mL，均顯著低于db/db 組（P＜0.01）。三組間TNF-α 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第5、12、19 天的F值分別為 18.055、30.762 和 35.471，P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術(shù)后第 5、12、19 天的傷口組織 TNF-α 表達(dá)量分別為（962.7±92.9）pg/mL、（1169.2±104.6）pg/mL 和（870.8±87.1）pg/mL，而db/db+EGCG 組TNF-α表達(dá)量分別為（771.2±79.2）pg/mL、（998.4±107.4）pg/mL 和（621.5±81.2）pg/mL，均顯著低于 db/db 組（P＜0.01）。三組間VEGF 比較的單因素方差分析在術(shù)后的第 5、12、19 天的F值分別為 22.098、50.117 和 30.005，P值均小于 0.001。db/db 小鼠在術(shù)后第 5、12、19 天的傷口組織 VEGF 表達(dá)量分別為（395.1± 36.7）pg/mL、（430.2± 28.2）pg/mL 和（377.5±26.8）pg/mL，而 db/db+EGCG 組 VEGF 表達(dá)量分別為（442.1±29.2）pg/mL、（490.2±24.3）pg/mL和（430.2±22.6）pg/mL，均顯著高于db/db 組（P＜0.01）。

3 討論

EGCG 作為從綠茶中提取的一種成分，是綠茶中最主要的活性和水溶性成分。大量研究證實(shí)，EGCG 具有非常強(qiáng)的抗氧化和抗炎抑菌功效，并被發(fā)現(xiàn)在抗腫瘤及治療心血管疾病中發(fā)揮了積極作用［6-8］。雖然近年來的研究也發(fā)現(xiàn)EGCG 能夠加速正常和1 型糖尿病軟組織的創(chuàng)傷愈合［9-12］，但是EGCG 是否能夠?qū)τ诟鼮榧智野l(fā)生率更高的2 型糖尿病的傷口愈合修復(fù)產(chǎn)生積極效果尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中使用了db/db 小鼠動(dòng)物模型作為2型糖尿病研究的實(shí)驗(yàn)工具。db/db 小鼠是瘦素受體特異性缺陷的基因修飾小鼠，瘦素作為脂肪組織分泌的激素分子，能夠作用于下丘腦的代謝調(diào)節(jié)中樞，發(fā)揮抑制食欲，減少能量攝取，抑制脂肪合成的作用。而瘦素受體缺陷的db/db 小鼠則表現(xiàn)出肥胖、高血糖、多飲、多尿、多食等與臨床2 型糖尿病相似的體征，而該模型小鼠也是目前實(shí)驗(yàn)室中對(duì)于2型糖尿病及其并發(fā)癥研究的最常用的動(dòng)物模型之一［13-15］。

圖5 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）治療對(duì)于2型糖尿病db/db小鼠傷口組織中重要細(xì)胞因子表達(dá)的影響：A為白細(xì)胞介素1β（IL-1β）；B為白細(xì)胞介素6（IL-6）；C為腫瘤壞死因子α（TNF-α）；D為血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

本研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)的傷口愈合速率均顯著低于空白對(duì)照組小鼠，同時(shí)db/db小鼠的創(chuàng)傷總愈合時(shí)間顯著高于空白對(duì)照小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠的傷口愈合進(jìn)程顯著延遲，這與臨床上2型糖尿病的傷口愈合特征類似［16］。本研究使用EGCG（10 mg/kg）對(duì)db/db小鼠的創(chuàng)傷進(jìn)行治療，該劑量已被諸多先前研究證實(shí)能夠顯著加速傷口的愈合和修復(fù)［11，17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG（10 mg/kg）在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著提升db/db 小鼠的傷口愈合速率，并能夠顯著縮短db/db 小鼠傷口愈合的總時(shí)長。本研究結(jié)果提示，EGCG 具有改善2型糖尿病db/db小鼠軟組織創(chuàng)傷愈合障礙，加速傷口愈合修復(fù)的作用功效。

本研究生物力學(xué)測試結(jié)果表明，db/db小鼠的傷口外周組織的抗張強(qiáng)度顯著低于空白對(duì)照的Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠傷口組織硬度和韌性顯著降低。而軟組織的抗張強(qiáng)度大小主要由膠原纖維的數(shù)量和排列所決定的［18］，因此本研究結(jié)果表明db/db小鼠傷口愈合速率降低與傷口位置膠原纖維的破壞部分相關(guān)。而本研究進(jìn)一步揭示，EGCG（10 mg/kg）在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著提升了db/db 小鼠傷口組織的生物力學(xué)抗張強(qiáng)度，提示EGCG能夠顯著抑制2型糖尿病傷口及其外周組織的膠原蛋白破壞進(jìn)程。

創(chuàng)傷發(fā)生后，其局部微環(huán)境的血流供應(yīng)在整個(gè)傷口的修復(fù)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。而大量研究也提示，2 型糖尿病的傷口修復(fù)功能障礙也與其高糖環(huán)境所誘發(fā)的局部微循環(huán)障礙具有密切關(guān)聯(lián)［19］。本研究通過激光多普勒血流測量發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠傷口位置的局部血流速率在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于空白對(duì)照的Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db 小鼠在傷口發(fā)生后的修復(fù)進(jìn)程中會(huì)全程伴隨著局部的微循環(huán)障礙這一問題。同時(shí)，本研究ELISA結(jié)果也揭示，對(duì)于血管新生起重要作用的細(xì)胞因子VEGF的表達(dá)，db/db小鼠在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于Control 組小鼠，進(jìn)一步揭示了2 型糖尿病小鼠會(huì)發(fā)生血管新生能力的顯著降低。而本研究也發(fā)現(xiàn)，EGCG（10 mg/kg）治療在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均能夠顯著提高db/db 小鼠傷口位置的局部血流速度；同時(shí)，EGCG 治療也在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)顯著提升了db/db 小鼠傷口位置VEGF的表達(dá)。本研究結(jié)果提示，EGCG能夠顯著改善2型糖尿病創(chuàng)傷部位的局部微循環(huán)狀態(tài)，促進(jìn)傷口處的血管新生。

炎癥反應(yīng)是軟組織的創(chuàng)傷發(fā)生過程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而諸多先前的研究表明2 型糖尿病傷口愈合修復(fù)中長期處于高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，這會(huì)顯著降低其傷口的修復(fù)速率［20］。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠傷口位置的炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Control 組小鼠，提示2 型糖尿病的db/db小鼠在創(chuàng)傷發(fā)生后長期處于局部高炎癥反應(yīng)狀態(tài)。而EGCG（10 mg/kg）治療在術(shù)后的各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低了db/db 小鼠傷口處IL-1β、IL-6和TNF-α水平。本研究結(jié)果提示，EGCG的促2型糖尿病傷口愈合效應(yīng)與其顯著的抗炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生物力學(xué)等角度系統(tǒng)揭示了EGCG能夠有效改善2型糖尿病db/db 小鼠的傷口愈合能力，而這一積極效應(yīng)與EGCG顯著的抗炎癥反應(yīng)、促血管新生、加速膠原沉積密切相關(guān)。本研究提示EGCG作為一種經(jīng)濟(jì)易得的中藥成分，具有可觀的治療2 型糖尿病傷口愈合障礙的臨床應(yīng)用前景。