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    胰高血糖素樣肽-1 對2 型糖尿病大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨和成脂分化的影響

    2020-09-13 14:14:24鄧穎黎金鳳陳志雄王晨秀胡雅琴黃水金劉精東程宗佑霍亞南
    安徽醫(yī)藥 2020年9期
    關(guān)鍵詞:成脂成骨分化

    鄧穎,黎金鳳,陳志雄,王晨秀,胡雅琴,黃水金,劉精東,程宗佑,霍亞南

    作者單位:江西省人民醫(yī)院、南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,江西 南昌330000

    糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的糖代謝紊亂的內(nèi)分泌綜合征[1-3]。糖尿病可有多種并發(fā)癥,腎、神經(jīng)、心血管、眼等器官的病變已廣為人知,而糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)生率也明顯增加[2,4-5]。1/2 以上的糖尿病病人骨密度降低,1/3病人被診斷為骨質(zhì)疏松[2,4-5]。因此探討糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療手段意義重大。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種主要由腸道L細胞產(chǎn)生的肽類激素,具有保護胰島β細胞功能,對糖尿病小鼠具有保護作用,也對骨質(zhì)疏松大鼠具有改善作用,從而提示GLP-1 可能對糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠具有保護作用[6-7]。因此本研究于2018 年8—12月將通過原代培養(yǎng)正常大鼠和2 型糖尿?。═2DM)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs),并利用GLP-1 干預(yù)BMSCs,探討GLP-1 對糖尿病大鼠BMSCs 成骨及成脂的作用。

    1 材料與方法

    1.1實驗材料20 只(200±20)g、4 周齡清潔級的雄性SD大鼠,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2016-0002,本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。

    1.2實驗試劑與儀器DMEM高糖培養(yǎng)基(gibco公司);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(Solarbio 公司);青鏈霉素混合液(100×)(Solarbio);成骨誘導(dǎo)液(RASMX-03021-175,cyagen);成 脂 誘 導(dǎo) A 液(RASMX-03031-175,cyagen);成 脂 誘 導(dǎo) B 液(RASMX-03032-175,cyagen);利拉魯肽注射液(諾和力公司);茜素紅染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);GLP-1(7-36)購于美國sigma 公司,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶解制成所需濃度。光學(xué)相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司);熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);流式細胞儀(美國BD公司);Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

    1.3 T2DM大鼠模型復(fù)制將20只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組及T2DM 組,每組10 只,正常組大鼠喂以普通飼料;T2DM 組大鼠喂以高脂飼料(其中含70%碳水化合物、20%蔗糖,10%豬油),每周測定大鼠的體質(zhì)量、飲水量和進食量。于第4 周末大鼠禁食14 h 后,腹腔注射25 mg/kg 鏈脲佐菌素(STZ)溶液(STZ 溶于0.1 mol/L,pH4.5 的檸檬酸緩沖液,配制為1%的溶液),3 d 后測量隨機血糖,血糖低于16.7 mmol/mL 的再次注射STZ 溶液加強模型,隨機血糖連續(xù)2 周均高于16.7 mmol/mL 且出現(xiàn)糖尿病癥狀的大鼠進行后續(xù)實驗。

    1.4 BMSCs的分離及培養(yǎng)將SD大鼠缺氧處死,75%乙醇浸泡15~20 min,無菌條件下取下脛骨和肱骨,將其兩端干骺端切除,顯露骨髓腔,用10%完全培養(yǎng)基徹底沖洗骨髓腔,并使骨髓細胞充分分散制成單細胞懸液,離心,棄去上清液,加入DMEM+20%胎牛血清(FBS)+雙抗培養(yǎng)液重懸,分別均勻的鋪在培養(yǎng)板中,并做好標(biāo)記,標(biāo)明代數(shù),置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),3 d換1次液。當(dāng)細胞的融合度達到90%以上時,棄去培養(yǎng)液,PBS 洗2 次,加入胰蛋白酶消化2~3 min,加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基,將細胞吹打下來并吸取到10 mL離心管中,離心,棄上清,注意不要碰到管口,并接種到新的培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.5 BMSCs的鑒定胰蛋白酶將融合度達到80%~90%的第3 代BMSCs 消化下來并制成單細胞懸液,將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL,分于3個已做標(biāo)記的微型離心管(EP管)中,分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD29、CD34、CD44、CD45單克隆抗體,室溫避光孵育30 min,PBS 洗滌沒有結(jié)合的抗體,最后加入PBS重懸細胞,于流式細胞儀上檢測上述標(biāo)志物的含量。

    1.6 BMSCs分組正常大鼠BMSCs(正常組),正常大鼠BMSCs+10 nmol/L GLP-1(正常組+10 nmol/L GLP-1),正常大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1(正常組+30 nmol/L GLP-1)。T2DM 模型大鼠 BMSCs(模型組),T2DM 模型大鼠 BMSCs+10 nmol/L GLP-1(模型組+10 nmol/L GLP-1),T2DM模型大鼠BMSCs+30 nmol/L GLP-1(模型組+30 nmol/L GLP-1)。

    1.7 BMSCs成骨誘導(dǎo)取生長狀態(tài)良好的BMSCs,按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板,按照“1.6”分組加入相應(yīng)濃度藥物和成骨誘導(dǎo)液,3 d換1次液,連續(xù)培養(yǎng)21 d 后做堿性磷酸酶(ALP)檢測和茜素紅染色。

    1.8 BMSCs成脂誘導(dǎo)取生長狀態(tài)良好的BMSCs,按 1×10-4個/孔接種至鋪有蓋玻片6 孔板,按照“1.6”分組加入相應(yīng)濃度藥物共同培養(yǎng),成脂誘導(dǎo)液A 液培養(yǎng)3 d 換成脂誘導(dǎo)液B 液誘導(dǎo)1 d,連續(xù)培養(yǎng)14 d后做油紅染色。

    1.9 ALP活性檢測在誘導(dǎo)第21 天時候,收集BMSCs,并用不含酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞,提取細胞總蛋白,并用BCA 蛋白試劑盒進行定量,最后根據(jù)ALP酶活性試劑盒測定ALP活性。

    1.10茜素紅染色在誘導(dǎo)第21天時候,去除培養(yǎng)基,PBS 洗滌細胞玻片,70%乙醇室溫固定細胞,茜素紅染色液覆蓋樣本,37 ℃避光孵育60 min;雙蒸水沖洗玻片3~5 min;熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照后加入10%氯化十六烷基吡啶,室溫30 min,將氯化十六烷基吡啶析出;從每個培養(yǎng)皿取出100 μL溶液加入96 孔板,選擇560 nm 波長進行光密度(OD)值測定,通過樣本總蛋白量對各組OD值進行標(biāo)化。

    1.11油紅染色在誘導(dǎo)第14 天,去除培養(yǎng)基,加入4%組織細胞固定液固定15 min;60%異丙醇充分浸潤,油紅染液染色8 min,60%異丙醇快速分化,蘇木素染色2 min,去除染色液,水洗,熒光倒置顯微鏡下觀察,鏡檢結(jié)束后加入100%異丙醇,室溫放置孵育30 min,選擇520 nm波長進行OD值測定。

    1.2統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析。觀測資料均為計量資料,用xˉ±s表示,多組比較采用單因素方差分析,多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 BMSCs的鑒定分離獲得的正常組大鼠BMSCs 細胞呈紡錘形或長梭形,核內(nèi)可見1~2 個核仁。同時采用流式細胞術(shù)檢測BMSCs表面標(biāo)志物,結(jié)果正常組及模型組大鼠的BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD44 陽性率均高于97%,CD34、CD45 陽性率均低于5%,從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好,純度高,能夠用于后續(xù)實驗。見圖1。

    2.2 ALP活性檢測與正常組(2.81±0.04)比較,正常組+10 nmol GLP-1(4.92±0.07)及正常組+30 nmol GLP-1(6.76±0.02)的ALP 活性升高,模型組(3.54±0.09)ALP 活性降低;與模型組比較,模型組+10 nmol GLP-1(5.11±0.10)及模型組+30 nmol GLP-1(5.80±0.17)的ALP活性升高(F=23.56,P=0.000)。說明隨著GLP-1 濃度升高,正常組及模型組成骨分化越多。

    2.3茜素紅染色結(jié)果與正常組(0.46±0.05)比較,正常組+10 nmol GLP-1(0.53±0.05)及正常組+30 nmol GLP-1(0.64±0.02)的OD值升高,模型組(0.09±0.01)OD 值降低;與模型組比較,模型組+10 nmol GLP-1(0.16±0.03)及模型組+30 nmol GLP-1(0.33±0.03)的OD 值升高(F=18.39,P=0.001)。說明隨著GLP-1濃度升高,正常組及模型組成骨分化越多。見圖2。

    2.4油紅染色結(jié)果與正常組(0.29±0.05)比較,正常組+10 nmol GLP-1(0.16±0.05)及正常組+30 nmol GLP-1(0.09±0.02)的OD值降低,模型組(0.66±0.01)OD 值升高;與模型組比較,模型組+10 nmol GLP-1(0.43±0.03)及模型組+30 nmol GLP-1(0.34±0.03)的OD 值降低(F=29.41,P=0.000)。說明隨著GLP-1濃度升高,可以抑制正常組及模型組的成脂分化。見圖3。

    3 討論

    糖尿病合并骨質(zhì)疏松作為糖尿病并發(fā)癥在近些年已逐漸得到專家學(xué)者認可,其是一種全身性、代謝性、退行性的骨科疾病,是糖尿病在骨骼系統(tǒng)中的主要并發(fā)癥[5]。病人單位體積的骨量減少,骨強度降低,骨組織微結(jié)構(gòu)改變是糖尿病骨質(zhì)疏松病人主要特征,超過50%的糖尿病病人患有骨質(zhì)疏松。研究顯示不管是1型糖尿?。═1DM)還是T2DM病人均較正常人群發(fā)生髖部骨折的風(fēng)險高[5,8-9]。因此探討糖尿病合并骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制具有重要意義。

    BMSCs是一種于1976年發(fā)現(xiàn),1991年正式命名的間充質(zhì)干細胞。BMSCs 來源于中胚層,能夠從臍帶、骨髓、羊水等多種組織中獲得,并能夠在誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下定向分化為軟骨細胞、成骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞、內(nèi)皮細胞等,進而修復(fù)受損的細胞[10-12]。BMSCs 由于易分離、易培養(yǎng),低免疫原性、易轉(zhuǎn)染外源基因及自我更新能力較強,因此被廣泛的應(yīng)用于骨退行性疾病,神經(jīng)退行行疾病,血管病性疾病等疾病的治療中[10-12]。因此本研究首先探討正常大鼠及T2DM大鼠中BMSCs的成骨及成脂分化的影響。原代培養(yǎng)獲得的BMSCs 經(jīng)過流式細胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)正常組大鼠及模型組大鼠的BMSCs 表面標(biāo)志物CD29、CD44陽性率均高于97%,CD34、CD45陽性率均低于5%,從而說明本實驗獲得的BMSCs均一性較好,純度高,能夠用于后續(xù)實驗。ALP 是BMSCs 向成骨細胞分化的早期標(biāo)志物之一,在成骨誘導(dǎo)的第3 天就開始表達,是骨鈣素及鈣結(jié)節(jié)形成的前提。本研究ALP 檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組BMSCs中ALP 活性低于正常組BMSCs,另外茜素紅染色結(jié)果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成骨分化減少,油紅染色結(jié)果表明模型組BMSCs 較正常組BMSCs 成脂分化增加,從而說明糖尿病對BMSCs 的成骨分化具有抑制作用,對BMSCs的成脂分化具有促進作用。

    GLP-1是一種主要由腸道L細胞產(chǎn)生的腸促胰島素,具有保護胰島β 細胞,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡的作用[6,13-14]。GLP-1 受體是 G 蛋白偶聯(lián)受體B 家族的一員,能夠廣泛地表達于人及鼠類的胰臟、心臟、肺、腦、胃等組織[6,13-14]。GLP-1 通過結(jié)合于 GLP-1 受體,使自身的 G 蛋白 α 亞基與 β、γ 亞基解離,進而介導(dǎo)細胞內(nèi)不同信號通路,發(fā)揮不同的生理作用[6,13-14]。研究已經(jīng)顯示 BMSCs 表面能夠表達GLP-1受體,GLP-1能夠顯著的促進BMSCs增殖,抑制BMSCs凋亡[15-17]。另外還有研究顯示GLP-1類似物唾液素-4(Exendin-4)能夠促進 BMSCs 向成骨細胞分化,同時還有改善大鼠骨質(zhì)疏松作用[7,18-19]。進而提示GLP-1對骨的保護作用。因此本研究將不同濃度的GLP-1加入到正常組大鼠及T2DM大鼠的BMSCs,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLP-1 不論是對正常大鼠的BMSCs 還是T2DM 大鼠的BMSCs 均具有成骨分化的促進作用,而對成脂分化具有抑制作用。

    綜上所述,T2DM 大鼠BMSCs 較正常大鼠BMSCs的成骨轉(zhuǎn)化作用減少,成脂作用增加。GLP-1的加入能顯著的促進T2DM 大鼠BMSCs 及正常大鼠BMSCs的成骨作用,減少成脂作用,從而說明GLP-1對T2DM 大鼠BMSCs 的成骨分化具有促進作用,對成脂分化具有抑制作用。

    (本文圖1~3見插圖9-2)

    圖1 流式細胞儀檢測各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)表面標(biāo)志物:A為正常組,B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1(GLP-1),C為正常組+30 nmol/L GLP-1,D為模型組,E為模型組+10 nmol/L GLP-1,F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖2 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成骨分化熒光倒置顯微鏡圖片(茜素紅染色×200):A為正常組,B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1(GLP-1),C為正常組+30 nmol/L GLP-1,D為模型組,E為模型組+10 nmol/L GLP-1,F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1 圖3 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)成脂分化熒光倒置顯微鏡圖片(油紅○染色×200):A為正常組,B為正常組+10 nmol/L胰高血糖素樣肽-1(GLP-1),C為正常組+30 nmol/L GLP-1,D為模型組,E為模型組+10 nmol/L GLP-1,F(xiàn)為模型組+30 nmol/L GLP-1

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