丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1 區(qū)Wnt3a及β-連環(huán)蛋白表達(dá)的影響

鄧春穎，李海濱，毛文靜，李世英，劉斌

作者單位：1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山063000；2遵化市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河北 遵化064200

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）目前被認(rèn)為是導(dǎo)致老年癡呆的主要原因，其發(fā)病率不斷上升，不僅嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，對社會經(jīng)濟(jì)亦造成不良影響。目前關(guān)于該病發(fā)病機(jī)制尚不明確［1］，亦沒有特效治療方法及藥物。丁苯酞（dl-3-nbutylphthalidle）是從芹菜籽中提取出來的小分子物質(zhì)，是我國自主研發(fā)的治療缺血性腦血管病的新藥。丁苯酞通過拮抗炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡等起到保護(hù)腦細(xì)胞作用［2］。而體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種程序受Wnt 信號通路控制［3］。研究表明，異常磷酸化的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在Wnt信號通路未啟動時(shí)明顯升高，導(dǎo)致β淀粉樣蛋白（Aβ）對腦神經(jīng)元毒性作用加大，而Aβ 大量沉積即可誘發(fā)AD［4-5］。Wnt 通路發(fā)揮抗凋亡作用的主要效應(yīng)因子是 β-catenin［6］。而 Wnt3a 是 Wnt 信號通路的啟動因子，觀察其濃度變化，可了解Wnt 信號通路激活情況。本研究于2017 年12 月至2018 年12 月通過觀察丁苯酞對Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達(dá)的影響，為AD治療尋找一個新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物2～3 月齡健康清潔級雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量范圍為250～280 g，實(shí)驗(yàn)動物購于北京華阜康生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK［京］2014-0010。將實(shí)驗(yàn)動物自由進(jìn)食喂養(yǎng)于華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室，室溫控制在24～26 ℃，相對濕度45%～55%，12 h 明暗交替光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)1周

1.2藥物與試劑丁苯酞軟膠囊（購于石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20050299，批號121101，規(guī)格0.1 克/粒）；兔抗大鼠Wnt3a 多克隆抗體、兔抗大鼠β-catenin 多克隆抗體（均購于北京博奧森生物公司）；兔二步法免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（均購于北京中杉生物有限公司）。

1.3主要儀器德國LEICA 公司的石蠟組織切片機(jī)；日本HITACHI 公司的透射電子鏡；安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司的腦立體定位儀；淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司的Morris 水迷宮；張家港市航天醫(yī)療電器有限公司的電凝儀。

1.4方法

1.4.1 動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為假手術(shù)組（Sham 組）、AD 模型組（AD 組）、丁苯酞治療組（丁苯酞組），造模成功后，在各組內(nèi)采用隨機(jī)數(shù)字表法分為造模后1、2、4和8周4個亞組。

1.4.2 模型制備 提前制備濃度為1 μg/μL的β-淀粉樣蛋白1-42（beta-amyloid people 1-42，Aβ1-42）溶液，并制成凝聚狀態(tài)。采用Morris水迷宮篩選大鼠，保留合格實(shí)驗(yàn)動物。采用腹腔注射方式麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側(cè)海馬CA1 區(qū)為注射區(qū)，以前囟為基準(zhǔn)點(diǎn)，向后4.5 mm，中線旁開2 mm 處，開顱，暴露大鼠硬腦膜，將微量注射器與腦表面垂直，緩慢進(jìn)針，深度2 mm，AD 組及丁苯酞組均緩慢注入5 μL 提前制備好的Aβ 溶液，留針10 min 后撤出針頭，用骨蠟封閉骨質(zhì)創(chuàng)口，縫合并消毒切口。Sham組注射5 μL 0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 給藥方法 造模4周時(shí)進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，造模前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義視為模型成功。丁苯酞組給予丁苯酞混合溶液（丁苯酞與食用油混合，濃度8 mg/mL，劑量1 mL/100 g）進(jìn)行灌胃，每日2次；Sham組、AD組給予同等劑量的食用油灌胃，每日2次，連續(xù)給藥1、2、4、8周。

1.4.4 免疫組織化學(xué)檢測 將大鼠喂養(yǎng)至各個時(shí)相點(diǎn)，腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，350 mg/kg）大鼠，麻醉后暴露心臟，由心尖插入灌注針并固定至升主動脈處，剪開右心耳快速灌注0.9%氯化鈉溶液，沖洗血管內(nèi)血漬，至肝臟變白后，用4%多聚甲醛滴注至大鼠僵硬后，斷頭取腦，分離腦組織，腦組織浸泡于4%多聚甲醛-磷酸緩沖鹽溶液（PBS）固定過夜，次日用石蠟包埋含海馬的腦組織，制備切片備用。取已經(jīng)制備好的腦組織切片標(biāo)本，加封閉液后分別滴加一抗，抗Wnt3a 抗體（1∶400）、抗β-catenin 蛋白（1∶300），4 ℃過夜，滴加二抗孵育后進(jìn)行DAB 顯色。參照試劑說明書進(jìn)行操作。免疫組織化學(xué)陽性標(biāo)準(zhǔn)為鏡下可見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈棕褐色。采集操作后的組織切片圖像（OLYMPUS攝像顯微鏡，400×），采用隨機(jī)數(shù)字表法觀察不重疊的各組大鼠海馬CA1 區(qū)6 個視野，導(dǎo)入Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測 大鼠喂養(yǎng)至各個時(shí)相點(diǎn)后，采用腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，350 mg/kg）大鼠，于冰臺上直接斷頭，迅速取出腦組織，用冷的PBS 漂洗后，分離出海馬組織。將取出的組織放入15 mL離心管中，加組織裂解液，充分研磨后于漿器中裂解40 min，裂解后離心取上清液，儲存于-80 ℃超低溫冰箱備用。實(shí)驗(yàn)前定量分裝蛋白，將其濃度調(diào)至800 μg/mL，加等體積上樣緩沖液后沸水中煮5 min。冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)檢測步驟：分別取各組蛋白樣品（50 μg），置于10% SDS-PAGE，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉2 h。分別加入一抗，抗Wnt3a抗體（1∶500）、抗β-catenin蛋白（1∶500），置于4 ℃冰箱孵育過夜，次日漂洗后加入羊抗兔二抗（1∶2 000），置于37 ℃反應(yīng)2 h，PBS洗膜3次加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/四唑淡藍(lán)（BCIP/NBT）顯色數(shù)分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以xˉ±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a、β-catenin免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果在Sham組中，Wnt3a、β-catenin蛋白在實(shí)驗(yàn)大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)可有少量表達(dá)。在AD 組中，實(shí)驗(yàn)大鼠各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)增多，1 周時(shí)表達(dá)量增多，2周時(shí)表達(dá)繼續(xù)增多，4周時(shí)最高，8周時(shí)稍有下降但仍有較多表達(dá)。與Sham組相比，Wnt3a蛋白在AD 組實(shí)驗(yàn)大鼠各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均增多（P＜0.05）；β-catenin蛋白在AD組大鼠各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與AD 組比較，Wnt3a、βcatenin 蛋白在丁苯酞組實(shí)驗(yàn)大鼠各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）。見表1，2 和圖1，2。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較/（個/高倍視野，）

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較/（個/高倍視野，）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與阿爾茨海默?。ˋD）組比較，bP＜0.01

images/BZ_14_1285_464_2240_514.png11.67±1.25 14.83±1.46a 17.17±1.77b 16.73＜0.01 Sham 組AD 組丁苯酞組F 值P 值666 8.17±1.34 10.50±0.96a 12.33±1.25b 15.29＜0.01 8.83±1.86 12.17±1.86a 15.17±1.21b 17.89＜0.01 10.17±1.07 16.67±0.94a 19.33±1.60b 72.56＜0.01

表2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果比較/（個/高倍視野，xˉ±s）

2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果各組大鼠海馬CA1 區(qū)Wnt3a、β-catenin 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果同免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，見表3，4和圖3。

3 討論

AD 是老年性癡呆中的代表疾病，其發(fā)生發(fā)展緩慢，且與年齡相關(guān)。AD 主要臨床表現(xiàn)是記憶力減退、進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、理解力及判斷力衰退等，甚至出現(xiàn)精神行為異常。老年斑形成是AD 的主要病理改變，其主要成分為Aβ 聚集、Tau 蛋白相關(guān)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFTs）、神經(jīng)元減少等。Aβ學(xué)說認(rèn)為AD 病人腦中堆積的過量Aβ，會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，并能引起腦部炎癥及細(xì)胞凋亡［7］。發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病機(jī)制，并對其進(jìn)行干預(yù)，可能達(dá)到改善病情的作用。Wnt/β-catenin信號通路被公認(rèn)為與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。Wnt/β-catenin 信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、對神經(jīng)元軸突生長及突觸發(fā)育起調(diào)節(jié)作用，亦參與凋亡等過程，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性起到保護(hù)作用［8-10］。Wnt3a 是Wnt 信號通路啟動因子，其表達(dá)量增加能促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化、增殖［11］。Wnt3a對海馬的增殖及分化也很重要，敲除Wnt3a基因的小鼠，海馬前體細(xì)胞增殖受限，致海馬功能受損［12］。β-catenin是位于Wnt信號通路下游中的關(guān)鍵因子，主要位于細(xì)胞膜，少量游離于細(xì)胞質(zhì)中，抑制β-catenin磷酸化，胞質(zhì)中其含量增加，對細(xì)胞核內(nèi)靶基因表達(dá)起調(diào)節(jié)作用［13］，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分化和凋亡等過程。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a、β-catenin在AD發(fā)病過程中減少，表明此機(jī)制參與發(fā)病過程。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，AD 模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1 區(qū)Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)增多，1周時(shí)表達(dá)增多，2周時(shí)表達(dá)繼續(xù)增多，4周時(shí)表達(dá)量最高，8周時(shí)稍有下降但仍處于較高水平，說明Wnt/β-catenin 信號通路在AD的演變過程中起著重要作用。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a相對表達(dá)量蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果比較/xˉ±s

表4 各組大鼠海馬CA1區(qū)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）相對表達(dá)量蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果比較/xˉ±s

丁苯酞是我國自主研發(fā)的新藥，廣泛應(yīng)用于臨床，用于治療缺血性腦血管。而丁苯酞除了具有改善循環(huán)、抗自由基等作用外，還具有抗氧化、抑制炎癥、抗凋亡等作用［14-16］。丁苯酞在應(yīng)用于急性缺血性腦卒中研究中發(fā)現(xiàn)丁苯酞能夠改善病人認(rèn)知功能［17-19］。王偉等［20］研究發(fā)現(xiàn)丁苯酞對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用可能是通過降低5-羥色胺的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。但國內(nèi)外關(guān)于通過干預(yù)Wnt/β-catenin 從而達(dá)到腦保護(hù)作用的研究較少。本研究免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果均表明，丁苯酞治療組大鼠海馬CA1 區(qū)Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達(dá)明顯增加，說明丁苯酞可通過上調(diào)Wnt/β-catenin 途徑中啟動因子Wnt3a 和下游因子β-catenin 的表達(dá)，發(fā)揮對AD 的腦保護(hù)作用，在給藥4 周時(shí)作用達(dá)到高峰，這為AD的治療提供了新的思路。

綜上，丁苯酞通過上調(diào)Wnt3a 及β-catenin 的表達(dá)，發(fā)揮對AD的治療作用，其與用藥時(shí)間有關(guān)。本研究為AD的治療提供新線索。

（本文圖1～3見插圖9-1）

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（免疫組織化學(xué)染色×400） 圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)β-連環(huán)蛋白（β-catenin）免疫組織化學(xué)結(jié)果（免疫組織化學(xué)染色×400） 圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)Wnt3a、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）蛋白電泳圖（蛋白質(zhì)印跡法）