豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒檢測方法研究進(jìn)展

李麗 陳弟詩 陳斌 鄧飛 邵靚 丁夢蝶 周莉媛

摘要：豬腹瀉相關(guān)的冠狀病毒是可引起豬只嘔吐、腹瀉和脫水等相關(guān)癥狀的傳染性疾病，仔豬感染后死亡率可達(dá)100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為此，眾多學(xué)者對該病的診斷與檢測方法進(jìn)行了大量的研究，建立了臨床診斷、病原分離等傳統(tǒng)的診斷方法以及免疫學(xué)、分子生物學(xué)等新興診斷方法。研究豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒的診斷與檢測方法對該類疫病的防控具有重要的意義。對豬腹瀉相關(guān)冠狀病毒的檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：豬;腹瀉;冠狀病毒;病原學(xué);免疫學(xué);分子生物學(xué);檢測方法

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）07-0011-03

豬腹瀉病是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，引起豬只腹瀉的病因很多，包括有營養(yǎng)性腹瀉、病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉和寄生蟲感染等，其中以病毒性腹瀉的發(fā)生率最高、危害最嚴(yán)重[1]。常見引起豬只腹瀉的病毒有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV），豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）和豬Delta冠狀病毒（Porcine deltacorona virus，PDCoV）[2]。這3種病毒均屬冠狀病毒科冠狀病毒亞科。病毒分類委員會將冠狀病毒分為甲型冠狀病毒、乙型冠狀病毒、丙型冠狀病毒和丁型冠狀病毒，其中PEDV和TGEV屬于甲型冠狀病毒，PDCoV屬于丁型冠狀病毒[3]。冠狀病毒是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形或橢圓形，大小在60～220 nm，基因組全長25～32 kb，含有多個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。豬冠狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式和病毒蛋白的表達(dá)與人及其他動物的冠狀病毒相似，大多數(shù)冠狀病毒包含四種結(jié)構(gòu)蛋白：一個大的表面糖蛋白（Spike或S），一個小的膜蛋白（SM），一個完整的膜糖蛋白（M）以及一個核衣殼蛋白（N）。甲型冠狀病毒其基因組由5非編碼區(qū)、0RF1、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3非編碼區(qū)組成。丁型冠狀病毒基因組從5-3依次為5非編碼區(qū)、ORF1ab、S、E、M、NS6、N、NS7、N和3非編碼區(qū)組成[4]。其中S基因保守區(qū)域，M基因和N基因常用作檢測的靶基因。PEDV、TGEV和PDCoV都能引起仔豬發(fā)生嘔吐和水樣腹瀉，嚴(yán)重還會導(dǎo)致厭食、脫水等癥狀，潛伏期短，傳播迅速，多發(fā)生在冬季，且以混合感染比較常見。病理剖檢以小腸內(nèi)壁明顯變薄，腸腔內(nèi)積滿黃色黏稠液體以及腸壁小腸黏膜絨毛萎縮、壞死為主要特征。這3種病臨床癥狀相似且常有混合感染的情況，給病原的鑒別診斷帶來了一定難度，因此對這3種病原進(jìn)行準(zhǔn)確快速的鑒別診斷，對該病的防控具有重要的意義。本文對此類疫病的病原檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1? 病原學(xué)檢測

1.1? 病毒的分離與鑒定

病原的分離鑒定是傳統(tǒng)的檢測方法，常采用細(xì)胞培養(yǎng)，雞胚接種和動物接種3種方法分離病原，其中細(xì)胞培養(yǎng)是目前分離冠狀病毒的最常用的方法。可用豬唾液腺、豬小腸上皮和豬甲狀腺原代細(xì)胞以及Vero、McClurkinST、LIC-PK和豬腎傳代細(xì)胞細(xì)胞系進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，根據(jù)病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中增殖的指標(biāo)即細(xì)胞代謝變化、血細(xì)胞吸附（HAd）、干擾現(xiàn)象和細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）評價病毒的感染效果，病毒數(shù)量與感染性指標(biāo)通過蝕斑實驗（PFU）和50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）進(jìn)行測定。常用Vero細(xì)胞分離PEDV，ST細(xì)胞分離TGEV以及LIC-PK細(xì)胞分離PDCoV。如任玉鵬等[5]等將疑似感染PEDV病豬病料處理后接種Vero細(xì)胞，經(jīng)連續(xù)傳代成功分離到PEDV DY毒株;孫秋燕等[6]利用ST細(xì)胞成功分離到兩株TGEV;秦毅斌等[7]利用LLC-PK傳代細(xì)胞系分離到一株P(guān)DCoV。研究證實，胰蛋白酶、氟林蛋白酶以及TMPRSS2蛋白酶等參與冠狀病毒S蛋白的激活，在冠狀病毒的感染和釋放中起重要作用，因此可通過添加蛋白酶增加相關(guān)病毒的分離率[8]。

1.2? 病毒的電鏡觀察

電鏡觀察也是檢測病原常用的方法之一，可通過電鏡負(fù)染法觀察病原的分布，在發(fā)病期間，病毒存在于病豬的許多器官中。尤其在空腸、十二指腸和腸系膜淋巴結(jié)中含病毒量最高。通過電鏡觀察，病毒粒子多分布于胞漿的空泡和腸壁微絨毛間隙，但這3種病原均為冠狀病毒且形態(tài)相似，普通透射電鏡觀察時很難區(qū)分，需要利用免疫電鏡技術(shù)進(jìn)行鑒別，免疫電鏡技術(shù)是一種將含有特殊標(biāo)記的抗原與抗體相互配對融合，借助特殊電子顯微鏡對抗原做出定位、定性和半定量的技術(shù)手段。王繼科等[9]設(shè)計出能快速定性PEDV和TGEV且具備3次篩選作用的電鏡技術(shù)，施雯[10]對PEDV進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，借助普通透射電鏡和免疫電鏡對比觀察，證實其表面具有典型的纖突結(jié)構(gòu)，該方法具有高度精確、快速靈敏等優(yōu)點，但是需要通過特殊的電鏡儀器，造價昂貴且不適用于大批量的樣本檢測。

2? 免疫學(xué)診斷技術(shù)

2.1? 血清中和實驗

中和實驗的原理是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，當(dāng)兩者結(jié)合后會減弱或消滅病毒感染力的實驗。動物受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體，并與相應(yīng)的病毒粒子呈現(xiàn)特異性結(jié)合，可通過檢測病原或產(chǎn)生的相應(yīng)抗體進(jìn)行確診。具體操作方法包括豬的接種法和細(xì)胞培養(yǎng)法，根據(jù)發(fā)病或細(xì)胞病變的情況判定結(jié)果。中和試驗常用的稀釋方法有兩種，一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數(shù)稀釋的病毒混合。此類檢測方法操作簡單，檢測快速，適用于大批量的樣本檢測，但抗體間存在交叉反應(yīng)，特異性不強(qiáng)，且因豬從感染病毒到產(chǎn)生抗體需要一定時間，所以也不適用于早期診斷。

2.2? 酶聯(lián)免疫吸附實驗

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELSA）是用特殊標(biāo)記抗原或抗體以檢測與之對應(yīng)的抗體或抗原的微量診斷技術(shù)，也是目前實驗室使用最廣泛的檢測方法之一。Rodak等[11]采用PEDV M蛋白的單抗設(shè)計出競爭ELISA，結(jié)果表明該方法適用于調(diào)查分析豬腹瀉病。張清真[12]建立了TGEV雙抗夾心ELASA檢測方法，最低檢測量為17.5 ng/μg，靈敏度高。Thachil等[13]利用PDCoV S1蛋白保守區(qū)域作為抗原建立間接ELISA方法。如今還衍生出細(xì)胞ELISA和ABS-ELASA等更高效、更快捷的新型檢測技術(shù)。該方法雖然具備很好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，診斷速度快且適用于大量的血清樣品鑒別分析，但是容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，造成誤檢。

2.3? 膠體金試紙條檢測技術(shù)

膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型技術(shù)，目前在檢測中的應(yīng)用主要是免疫層析法和快速免疫金滲濾法，此方法檢測病原具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點。賈宇旻等[14]等建立了快速檢測豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的膠體金免疫層析方法（GICA），與RT-PCR陽性符合率為93%，檢測快速且對檢測人員無特殊要求，適合豬場腹瀉病原的快速檢測，但檢測結(jié)果有待進(jìn)一步確認(rèn)。

3? 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

3.1? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是實驗室常用且十分重要的分子生物學(xué)技術(shù)之一，它是以待檢或需要特定擴(kuò)增的DNA片段為模板，利用DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，通過特異性引物，經(jīng)變性、退火和延伸組成一個完整反應(yīng)周期進(jìn)行循環(huán)復(fù)制。由于異物序列與目的基因必須嚴(yán)格配對，這也決定PCR方法具有很高的特異性。隨后出現(xiàn)的商品化PCR檢測試劑盒使得該檢測技術(shù)在操作上更加簡單、方便和快捷，得到廣泛應(yīng)用。在實際生產(chǎn)中，人們根據(jù)不同需求，運(yùn)用傳統(tǒng)生物技術(shù)結(jié)合近代基因工程衍生出熒光定量PCR、原位PCR、巢氏PCR、多重PCR和恒溫隔絕式PCR等一些新型的PCR方法。其中針對M基因、N基因和S基因保守區(qū)域設(shè)計引物的RT-PCR法是目前臨床應(yīng)用中最常用的方法，該方法特異性好，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確。韋學(xué)雷等[15]針對PEDV、PDCoV和TGEV的M、N、S基因保守區(qū)域設(shè)計引物，建立了能同時檢測3種病原的多重RT-PCR方法。與單重RT-PCR方法相比，多重RT-PCR方法可實現(xiàn)單次多種病原的同時檢測，省時省力。熒光定量PCR也是近年發(fā)展迅速的一門檢測技術(shù)，通過在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，并實現(xiàn)對未知模板定量分析。這種方法克服了傳統(tǒng)PCR易污染和缺乏準(zhǔn)確定量的缺點，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點，國內(nèi)外眾多學(xué)者建立了多種針對PEDV、TGEV和PDCoV的單重或多重?zé)晒舛縋CR方法。如施開創(chuàng)等[16]建立了PEDV、TGEV和PRCoV多重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，此方法可快速、高效、準(zhǔn)確地對病原實現(xiàn)鑒別診斷，為疾病的早期防控奠定了基礎(chǔ)。除此之外，適用于現(xiàn)場快速檢測的恒溫隔絕式PCR也得到廣泛的應(yīng)用，這種方法解除了實驗設(shè)備及復(fù)雜操作的束縛，可實現(xiàn)產(chǎn)房現(xiàn)場快速檢測，實現(xiàn)病原的早診斷、早預(yù)防。

3.2? 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新的體外擴(kuò)增特定DNA片段的方法。該技術(shù)依賴于自動循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，在等溫條件下，1 h內(nèi)即能擴(kuò)增1×109拷貝的靶序列，核酸研究和病原學(xué)檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用。羅亞坤等[17]建立了豬流行性腹瀉病毒的LAMP檢測方法，在60 ℃恒溫下反應(yīng)60 min，能特異性地擴(kuò)增出豬流行性腹瀉病毒的核酸片段，與常規(guī)RT-PCR方法的符合率達(dá)到97.3%，LAMP檢測方法無需額外的昂貴設(shè)備，僅需要水浴或加熱塊在30～60 min內(nèi)擴(kuò)增大量核酸且結(jié)果易觀察，操作方法簡便、敏感性和特異性高，可以用于相關(guān)冠狀病毒臨床病料的快速檢測，但由于其費(fèi)用昂貴且容易產(chǎn)生氣溶膠污染，在臨床上并未得到廣泛應(yīng)用。

3.3? 基因芯片、核酸探針雜交技術(shù)

基因芯片技術(shù)是同時將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效解讀和分析，如劉志鵬[18]建立了同時檢測PEDV、TGEV、GAR和PDCoV的可視化寡核苷酸芯片，為4種豬腹瀉病毒的同步鑒別診斷提供了一種新的分子診斷技術(shù)。核酸探針是將特定標(biāo)記物通過隨機(jī)引物法、PCR法和缺口平移法等標(biāo)記到某段特定的核苷酸上，與待檢核酸樣品在一定的支持物上進(jìn)行雜交，然后通過一定顯示系統(tǒng)來探查靶核酸的一種特異性檢測方法。這2種新興技術(shù)具有特異性好、靈敏度高和便捷快速等優(yōu)點，在臨床診斷上具有良好的發(fā)展前景。

3.4? 限制性酶切片段長度多態(tài)性分析

限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（Restriction fragmen tlength polymorphism，RFLP）是一種區(qū)分具有抗原相關(guān)性病毒的有效手段，將抗原性較近的病毒核酸用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后對酶切的產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而可以達(dá)到區(qū)分被檢病毒核酸的目的。此方法可以用來鑒別野毒株與疫苗株及強(qiáng)毒株和弱毒株[19]，利于對流行毒株進(jìn)行精準(zhǔn)檢測，以便從分子層面制定防控措施。

4? 討論

豬腹瀉病毒流行廣泛，危害嚴(yán)重。與仔豬病毒性腹瀉相關(guān)的猜原主要以冠狀病毒為主，包括TGEV、PEDV、PDCoV、PHEV和SADS-CoV，雖然豬的冠狀病毒都有共同的分子生物學(xué)特征，但要求對不同的疾病采取有針對性的預(yù)防和控制措施。尤其是前3種病毒已在我國豬群中長期存在且污染面廣，由于它們在臨床上都可以引起豬的嘔吐、腹瀉等癥狀，而且都屬于冠狀病毒，難以從臨床癥狀和病原學(xué)形態(tài)方面加以區(qū)分，因此必須通過實驗室診斷而確診，只有開展快速有效的檢測，才能早診斷、早預(yù)防，為開展疾病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。