番鴨巴氏桿菌的分離鑒定及體外抑菌實(shí)驗(yàn)

陳飛虎 ，張夢(mèng)娟 ，周亞南 ，高 蕊，區(qū)海蘊(yùn)，劉雨星，王笑焓，朱芝秀

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045)

巴氏桿菌是一種兩端鈍圓，中間稍微向外凸出的G-短桿菌[1]，是造成巴氏桿菌病的病原菌，病料瑞氏染色特征為兩極濃染[2]。臨床上，巴氏桿菌病是一種表現(xiàn)為畜禽急性、敗血性的一類疾病[3]，牛雞鴨豬兔等均有可能感染該傳染病[4]，鴨場(chǎng)中易群發(fā)該病，發(fā)病傳染急而迅速，并且病鴨短時(shí)間死亡[5～6]，對(duì)養(yǎng)禽場(chǎng)造成嚴(yán)重?fù)p害。2019年4～6月間，南昌某番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)疑似巴氏桿菌病例，本試驗(yàn)通過對(duì)疑似病例進(jìn)行病理解剖及細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定等操作，為對(duì)番鴨巴氏桿菌的防治提供良好建議與適當(dāng)方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病料：某養(yǎng)殖場(chǎng)病死成年番鴨；試驗(yàn)小白鼠：18～22g，南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室購買。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

電子數(shù)顯微游標(biāo)卡尺（購自上海美耐特旗艦店）；PCR儀（購于Bio-Rad公司）；牛津杯（購自上海申源科學(xué)儀器有限公司）；微量生化管及藥敏試紙（購自杭州天和微生物有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 病理檢查

臨床解剖：觀察氣管環(huán)、喉頭、肺、心肌及心內(nèi)外膜、心冠脂肪、腸黏膜等組織出血狀況；觀察肝臟病變情況；截取心臟、肝臟病變部位進(jìn)行瑞氏染色鏡檢。

2.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌操作取死亡鴨心、肝器官，勾取病變部位劃線接種5%兔血平板，37℃溫箱靜置24h，觀察血平板優(yōu)勢(shì)菌落形態(tài)、溶血狀況等；接種環(huán)無菌操作挑取單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)；挑取鏡檢菌落再次劃線接種5%兔血平板進(jìn)行純培養(yǎng)，分離菌命名為：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2。

2.1.3 分離菌生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

勾取 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2，分別接種微量生化反應(yīng)管，同時(shí)在微量生化反應(yīng)管中滴加無菌血清1～2滴，37℃下靜置1～2d，觀察生化反應(yīng)管反應(yīng)情況，對(duì)照生化反應(yīng)說明書分析并記錄結(jié)果。

2.1.4 分離菌分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細(xì)菌16srDNA通用引物[7]，用細(xì)菌常規(guī)擴(kuò)增法對(duì)分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。由湖南擎科生物科技有限公司測(cè)序，進(jìn)入Blast系統(tǒng)進(jìn)行16srDNA同源性分析，利用DNAStar軟件構(gòu)建16srRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.2 分離菌體外抑菌

2.2.1 藥敏試驗(yàn)

無菌條件下，均勻涂布 Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2發(fā)酵液于血清平板，用眼科鑷夾取藥敏紙片輕貼血清平板表面，記錄藥敏紙片藥物名稱及放置順序，37℃靜置24h，觀察抑菌情況，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.2.2 乳酸菌對(duì)分離菌體外抑制試驗(yàn)

將分離菌發(fā)酵液均勻涂布血清平板，其上對(duì)稱放置2個(gè)牛津杯，把雞唾液乳桿菌、豬小腸乳桿菌發(fā)酵液依次緩慢注入牛津杯內(nèi)，3 7℃靜置24h，觀察抑菌現(xiàn)象并測(cè)量抑菌圈的直徑。

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將購買的試驗(yàn)小白鼠適應(yīng)環(huán)境一周后隨機(jī)分為5組。試驗(yàn)組分別腹腔注射Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2發(fā)酵液（0.1mL/只），對(duì)照組同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察試驗(yàn)小白鼠的發(fā)病情況，對(duì)具有典型癥狀的死亡小白鼠進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

3 結(jié)果

3.1 臨床檢查結(jié)果

氣管環(huán)出血（圖1），心冠脂肪出血（圖2），肝臟針尖狀壞死（圖3）。取肝臟瑞氏染色境檢，表現(xiàn)為典型的兩極著色（圖4）。

3.2 病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果

Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2 在 5%兔血平板上呈水滴樣，半透明，不溶血（圖5），經(jīng)G染色鏡檢可見G-短桿菌（圖6）。

圖1 氣管環(huán)出血

圖2 心冠脂肪出血

圖3 肝臟針尖狀壞死

圖5 分離菌血平板菌落

圖6革蘭氏染色結(jié)果

圖4瑞氏染色結(jié)果

3.3 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由 表 2 可 知 ：Y-X-1、Y-X-2、Y-G-1、Y-G-2可分解葡萄糖等，其中Y-X-2分解麥芽糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，另外3株分離菌不產(chǎn)氣只產(chǎn)酸，乳糖不分解。

表2 分離菌生理生化特性

3.4 分離菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果如圖7所示，目的條帶在約1800pb處出現(xiàn)。擴(kuò)增后的序列與多殺性巴氏桿菌同源性高至 99%（圖 8），Y-G-1與 MG597107.1菌株，Y-X-1與KX579748.1菌株的親緣關(guān)系最近，進(jìn)化樹上處于同一分支（圖9）。

圖7 分離菌電泳結(jié)果

3.5 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，分離菌對(duì)頭孢曲松等抗生素敏感，對(duì)克林霉素等耐藥

3.6 乳酸菌對(duì)分離菌體外抑制試驗(yàn)結(jié)果

圖8 分離菌16S rDNA同源性分析

圖9 分離菌16S rRNA序列進(jìn)化樹

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

見表4可知，兩種不同源乳酸菌對(duì)分離菌均產(chǎn)生了抑制作用，顯然雞唾液乳桿菌對(duì)分離菌的抑制作用更明顯。

表4 乳酸菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mm

3.7 動(dòng)物致病性結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠均死于攻毒后的12h之內(nèi)，對(duì)照組生理狀態(tài)正常。從解剖死亡小鼠臟器中分離到形態(tài)一致的細(xì)菌，染色鏡檢結(jié)果與原分離菌一致。

4 討論

根據(jù)病理剖檢、分離菌培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)等結(jié)果，對(duì)比《伯杰氏細(xì)菌分離鑒定手冊(cè)》[9]，可初診分離菌為巴氏桿菌；依據(jù)上述分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，分離菌確診為多殺性巴氏桿菌。

分離菌生化反應(yīng)結(jié)果與劉燕發(fā)表的試驗(yàn)結(jié)果大致相同[10]，只有個(gè)別糖酵解試驗(yàn)不同，可能與菌株、地域差異有關(guān)。分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)阿莫西林等高敏，與劉杰等發(fā)表的論文結(jié)果不同，可能是用藥習(xí)慣、菌株與地域不同造成[11]。

體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，乳酸菌對(duì)巴氏桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，與邊彥超等發(fā)表的文章一致[12～13]。乳酸菌與高敏藥物配合使用，可以緩解抗生素泛濫所導(dǎo)致的耐藥性問題。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)小白鼠均于12h內(nèi)死亡，分離菌有較強(qiáng)的毒力，可能與菌株的莢膜有關(guān)[14]。

我國作為農(nóng)業(yè)大國，畜牧業(yè)快速發(fā)展，集約化規(guī)模養(yǎng)殖也越來越普遍，禽類巴氏桿菌病作為一類高發(fā)接觸性傳染病更得受到重視。畜牧場(chǎng)應(yīng)當(dāng)建立合理的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，做好防治，保持空氣流通，環(huán)境衛(wèi)生等條件，同時(shí)做好免疫預(yù)防。一旦發(fā)現(xiàn)發(fā)病禽類個(gè)體，應(yīng)當(dāng)立即隔離，嚴(yán)格消毒污染場(chǎng)所，以防更大范圍的感染，用藥方面應(yīng)當(dāng)追求合理配藥，防止濫用。