Apelin/APJ系統(tǒng)在肢體缺血再灌注所致肺損傷中的保護(hù)作用

董嬌嬌 金周晟 蔡瑤瑤 陳鴻飛 夏芳芳

肢體缺血再灌注（limb ischemia-reperfusion，LIR）損傷是一種常見(jiàn)的臨床現(xiàn)象，研究證實(shí)LIR不僅可引起局部組織的損傷，亦可引起其它遠(yuǎn)隔器官及組織如肺、腎、心、胰腺、脊髓等的損傷，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至多器官功能衰竭[1]。肺作為較易受損的器官之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致呼吸窘迫綜合征[2]，如何減輕LIR損傷導(dǎo)致的肺損傷是臨床治療的關(guān)鍵。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的配體，廣泛分布于全身重要器官。研究表明Apelin與其受體APJ結(jié)合，可以在心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中起保護(hù)作用[3]。Fan等[4]發(fā)現(xiàn)Apelin/APJ系統(tǒng)通過(guò)減輕肺部炎癥反應(yīng)和過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)肺損傷有保護(hù)作用。而Apelin對(duì)LIR繼發(fā)的肺損傷是否同樣具有保護(hù)作用，至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)建立大鼠LIR繼發(fā)肺損傷模型，檢測(cè)相關(guān)肺損傷指標(biāo)及蛋白通路表達(dá)情況，探討Apelin/APJ系統(tǒng)在LIR所致肺損傷中的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 SD成年雄性大鼠24只，體重300～350g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009]。[Pyr1]-Apelin-13購(gòu)自英國(guó)Tocris公司；APJ拮抗劑Apelin13（F13A）購(gòu)自美國(guó)PhoenixPharmaceuticals公司；IL-6和TNF-琢ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司；丙二醛（mal原ondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dis原mutase，SOD）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；解偶聯(lián)蛋白2（un原coupling protein2，UCP2）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；茁-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；UCP2和GAPDH引物由北京 Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠LIR損傷模型構(gòu)建 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（CON組）、肢體缺血再灌注組（IR組）、Apelin處理組（APL組）、Apelin+APJ拮抗劑組（APLF組），每組6只。除CON組外，其他各組根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]制作大鼠LIR肺損傷模型。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。采用20%烏拉坦8 ml/kg腹腔注射麻醉后，左頸外靜脈置管建立靜脈通路，采用微量輸液泵（Graseby 3500型，英國(guó)Graseby公司）輸注0.9%氯化鈉注射液3 ml/（kg·h）補(bǔ)充不顯性體液丟失；右頸內(nèi)動(dòng)脈置管，連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)（Rm6240多道生理信號(hào)處理采集系統(tǒng)，成都儀器廠），測(cè)定平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）、心率（heart rare，HR）、心率與收縮壓的乘積（rate pressure product，RPP）。平衡 30 min 后，靜脈注射肝素50 U行肝素化處理。下腹部消毒備皮，沿腹正中線左側(cè)剪開(kāi)一長(zhǎng)約1耀2 cm的縱切口，暴露腹腔，分離并游離腹主動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾夾閉髂總動(dòng)脈分叉上方0.5 cm處腹主動(dòng)脈，以阻斷處遠(yuǎn)端動(dòng)脈管腔變扁平且搏動(dòng)消失為成功標(biāo)志，缺血3 h，隨后松開(kāi)無(wú)創(chuàng)微動(dòng)脈夾，再灌注3 h。缺血再灌注期間用37益0.9%氯化鈉注射液浸潤(rùn)的紗布覆蓋腹部切口，保持大鼠自主呼吸，并維持中心溫度在（37依0.5）益，分別于平衡末及實(shí)驗(yàn)?zāi)┙?jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈處采血進(jìn)行血?dú)夥治觯╥-STAT血?dú)夥治鰞x，美國(guó)i-STAT公司）。

1.2.2 動(dòng)物分組 CON組：僅分離腹主動(dòng)脈，不夾閉；IR組：肢體缺血3 h再灌注3 h，缺血及再灌注前分別給予0.9%氯化鈉注射液0.75 ml/kg；APL組：肢體缺血3 h再灌注3 h，缺血前給予0.9%氯化鈉注射液0.75 ml/kg，再灌注前給予150滋g/kg[Pyr1]-Apelin-13（濃度200滋g/ml，相當(dāng)于0.75 ml/kg）；APLF組：肢體缺血3 h再灌注3 h，缺血前給予150滋g/kg APJ拮抗劑F13A（濃度200滋g/ml，相當(dāng)于0.75 ml/kg）預(yù)處理，再灌注前給予150滋g/kg[Pyr1]-Apelin-13。

1.2.3 標(biāo)本采集 再灌注3 h后，立即抽取大鼠腹主動(dòng)脈血4 ml靜置60 min并離心（4 000 r/min，離心10 min），取上清液置于-80益冰箱保存待測(cè)。取血結(jié)束后處死大鼠，開(kāi)胸暴露雙肺，分別結(jié)扎兩側(cè)肺門(mén)離斷雙肺，右肺用于病理學(xué)檢查及濕重/干重（W/D）測(cè)定，左肺沖洗后置于液氮中保存待測(cè)。

1.2.4 肺W/D測(cè)定 取右肺第四葉，濾紙吸凈表面水分并稱重記錄為肺濕重（W），然后置于60益烘箱（電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司）烘干72 h至恒重，記錄為肺干重（D），求W/D值。

1.2.5 炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 血漿上清液解凍，分別檢測(cè)IL-6、TNF-琢、MDA水平及SOD活性。左肺組織勻漿離心取上清液，分別檢測(cè)MDA水平及SOD、MPO活性。ELISA法測(cè)定IL-6、TNF-琢水平；硫代巴比妥法測(cè)定MDA水平；黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性；化學(xué)比色法測(cè)定MPO水平，均參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 病理學(xué)檢查 取右肺第二葉組織置入10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，光學(xué)顯微鏡（BX51型，日本Olympus公司）觀察肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)改變、間質(zhì)充血水腫、炎癥浸潤(rùn)等情況。

1.2.7 肺組織UCP2蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法。檢測(cè)取50 mg左肺組織，采用強(qiáng)效裂解液勻漿提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，取50滋g蛋白上樣，用SDSPAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。一抗稀釋液配制UCP2抗體（1:200）和 茁-actin抗體（1:3 000）孵育，分別置于相應(yīng)一抗液中4益搖床孵育過(guò)夜。洗膜后再用1:5 000的山羊抗兔IgG（H+L）室溫孵育1 h，ECL法顯色并分析結(jié)果。

1.2.8 UCP2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。先采用Trizol法提取肺組織總RNA，然后按說(shuō)明書(shū)用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用q-PCR法進(jìn)行基因擴(kuò)增，2-吟吟Ct相對(duì)定量法計(jì)算UCP2基因表達(dá)水平。GAPDH為內(nèi)參基因，UCP2引物設(shè)計(jì)為T(mén)CACCCAATGTCGCTCGTA（正義），GGCAGGGAAGGTCATCTGT（反義），GAPDH引物設(shè)計(jì)為GGCTACACTGAGGACCAGGTTG（正義），CCAGGAAATGAGCTTGACGAA（反義）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體重、基礎(chǔ)血流動(dòng)力學(xué)及平衡后血?dú)夥治鼋Y(jié)果的比較 4組大鼠體重、基礎(chǔ)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（MAP、HR、RPP）及平衡后基礎(chǔ)血?dú)夥治觯╬H、PaO2、PaCO2、乳酸）比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 4組大鼠再灌注末血?dú)夥治黾癢/D值的比較 CON組和APL組比較，pH、PaO2、PaCO2、乳酸均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。IR組和APLF組pH值及PaO2顯著低于CON組和APL組（均P＜0.05），而PaCO2顯著高于CON組和APL組（P＜0.01）；APLF組乳酸顯著高于CON組和APL組（P＜0.05）；和CON組和APL組比較，IR組乳酸有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。CON組和APL組比較，W/D值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；IR組及APLF組的W/D值顯著高于CON組和APL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 4組大鼠血及肺組織炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 CON組和APL組比較，血及肺組織各炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。與APL組比較，IR 組和 APLF組 IL-6、TNF-琢、MDA 水平均明顯升高（均P＜0.01），而SOD活性降低（均P＜0.01）；IR組和APLF組肺組織MDA水平及MPO活性明顯升高（均P＜0.05），而SOD活性顯著降低（均P＜0.01）。與CON組比較，APL組肺組織MPO活性亦有升高（P＜0.05）。見(jiàn)表 3。

2.4 肺組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，CON組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，由單層肺泡上皮細(xì)胞組成，肺間質(zhì)無(wú)明顯充血水腫；IR組肺組織大部分肺泡破裂，腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及水腫液聚集，肺間質(zhì)明顯增厚水腫，伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；和IR組比較，APL組肺泡破壞程度明顯改善，腔內(nèi)無(wú)明顯紅細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)增厚不明顯；APLF組肺組織肺泡破壞明顯，肺間質(zhì)充血水腫，程度和IR組相當(dāng)。見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

表1 4組大鼠體重、基礎(chǔ)血流動(dòng)力學(xué)及平衡后血?dú)夥治鼋Y(jié)果的比較

表2 4組大鼠再灌注末血?dú)夥治黾癢/D值的比較

表3 4組大鼠血漿及肺組織炎癥指標(biāo)及氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

圖1 4組大鼠光鏡下肺組織HE染色結(jié)果（A：CON組；B：IR組；C：APL組；D：APLF組；HE染色，×400）

2.5 UCP2蛋白及mRNA表達(dá)水平 APL組UCP2蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著高于CON組、IR組及APLF組（均P＜0.05），其余各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0.05），見(jiàn)圖 2、3。

圖2 4組大鼠肺組織解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）蛋白表達(dá)電泳圖及表達(dá)水平比較（與APL組比較，*P＜0.05）

圖3 4組大鼠肺組織解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）mRNA表達(dá)水平比較（與 APL組比較，*P＜0.05）

3 討論

本研究中，APL組的肺組織W/D比較IR組和APLF組低，同時(shí)其血?dú)夥治鲋械腜aO2高于而PaCO2低于IR組和APLF組，說(shuō)明外源性補(bǔ)充Apelin-13能顯著改善LIR引起的肺損傷，從而提高氧合，改善肺換氣。在光鏡下，APL組肺組織中出血及滲出均明顯少于IR組和APLF組。APL組炎癥指標(biāo) IL-6、TNF-琢、MDA、MPO較IR組和APLF組均明顯下調(diào)，而SOD活性顯著升高，同時(shí)UCP2蛋白較IR組和APLF組增多，提示Apelin可能通過(guò)上調(diào)UCP2減少炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)從而達(dá)到肺保護(hù)目的。

本研究中，IR組大鼠的肺組織在光鏡下出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量滲出液及紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞，與CON組相比，肺損傷顯著。這些病理改變與文獻(xiàn)報(bào)道[1]的肢體缺血再灌注造成肺損傷的變化相一致，說(shuō)明本研究肢體缺血3 h再灌注3 h繼發(fā)肺損傷模型制備成功。與傳統(tǒng)的肢體環(huán)扎法阻斷下肢血供造成肢體缺血再灌注相比，本研究用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈效果更為可靠，且經(jīng)過(guò)改良切口大小及減少創(chuàng)傷的操作，大大減少了動(dòng)物的損傷，此方法簡(jiǎn)便、易行，符合實(shí)驗(yàn)要求。

Zhang等[6]在其實(shí)驗(yàn)中顯示褪黑素能保護(hù)博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺損傷，他還發(fā)現(xiàn)在博萊霉素導(dǎo)致的小鼠肺損傷中，Apelin-13的表達(dá)顯著下調(diào)，但是這種效應(yīng)能被褪黑素逆轉(zhuǎn)，而Apelin抑制劑ML221又可以逆轉(zhuǎn)褪黑素對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，提示Apelin可能是肺保護(hù)的關(guān)鍵治療位點(diǎn)。本研究中，建立LIR肺損傷模型后，直接注射外源性Apelin-13，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Apelin-13能顯著改善LIR引起的肺損傷，其W/D及PaO2均顯著優(yōu)于IR組和APLF組，這個(gè)結(jié)果與Zhang的研究結(jié)果相一致。最近研究表明，Apelin在肺部疾病中起著重要的作用。Visser等[7]發(fā)現(xiàn)新生大鼠長(zhǎng)時(shí)間暴露于缺氧條件下，Apelin可減輕肺部炎癥，增加cGMP水平和肺泡化，促進(jìn)肺血管生成。同樣在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)Apelin能降低大鼠炎癥水平，APL組血漿IL-6、TNF-琢水平及肺組織MPO活性均顯著降低，且其抗炎作用能夠被APJ受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn)，該結(jié)果和Visser等研究結(jié)果類似。上述的研究結(jié)果提示Apelin可能通過(guò)減輕炎癥而實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)功能。

相比CON組，IR組反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化水平的指標(biāo)MDA顯著升高而反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的指標(biāo)SOD大大降低，而給予外源性Apelin-13處理后能夠大大降低LIR所致肺損傷大鼠體內(nèi)MDA水平，提高SOD活性。缺血再灌注損傷和氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)密切相關(guān)。再灌注期缺血組織瞬間恢復(fù)供血供氧，產(chǎn)生大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），后者攻擊細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生過(guò)氧化產(chǎn)物，兩者共同損傷細(xì)胞。另一方面，機(jī)體進(jìn)行防御，會(huì)反饋性提高機(jī)體SOD含量，維持氧化與抗氧化平衡[8]。線粒體是缺血再灌注損傷較敏感的細(xì)胞器之一，解偶聯(lián)蛋白（un原coupling proteins，UCPs）是一種線粒體內(nèi)膜蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝功能及生理病理應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用。UCP2蛋白參與細(xì)胞各項(xiàng)生理功能，尤其在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮了重要作用[9]。文獻(xiàn)報(bào)道UCP2不僅能抑制ROS，還能通過(guò)促進(jìn) NF-資B 及內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達(dá)，增加eNOS、NO的產(chǎn)生，抑制caspase的活化、凋亡，減少線粒體鈣聚集、膜超極化，抑制cyto C的釋放，抑制mPTP開(kāi)放，減少線粒體損傷[10-13]。由此可見(jiàn)，UCP2是線粒體氧化損傷的一個(gè)治療靶點(diǎn)。線粒體功能障礙已被認(rèn)為是肺上皮細(xì)胞損傷的一個(gè)標(biāo)志[14]。線粒體的損傷可導(dǎo)致大量活性氧ROS的產(chǎn)生[15]，ROS反向誘發(fā)破壞線粒體功能和質(zhì)膜完整性，兩者惡性循環(huán)，是細(xì)胞氧化損傷的主要原因，最終導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮的損傷、肺水腫，影響肺功能[16]。因此，線粒體的結(jié)構(gòu)、功能異常與肢體缺血再灌注肺損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，尤其是肺缺血后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。本研究結(jié)果中，外源性補(bǔ)充Apelin顯著上調(diào)UCP2蛋白，表明Apelin/APJ系統(tǒng)可能通過(guò)增加線粒體UCP2蛋白含量從而減輕線粒體氧化損傷，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平，本研究結(jié)果顯示APL組MDA降低、SOD升高也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，筆者猜測(cè)Apelin可能是通過(guò)上調(diào)UCP2的表達(dá)改善了線粒體功能，從而抑制氧化應(yīng)激損傷，最終實(shí)現(xiàn)肺保護(hù)。

本研究表明Apelin/APJ系統(tǒng)能夠從抗炎和抗氧化兩方面對(duì)LIR所致肺損傷進(jìn)行保護(hù)，但本研究沒(méi)有深入探討Apelin對(duì)線粒體功能的直接影響，這也是本課題組之后需要探索的研究。

綜上所述，Apelin/APJ系統(tǒng)可減輕大鼠肢體缺血再灌注引起的肺損傷，其保護(hù)機(jī)制可能與減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)，通過(guò)上調(diào)線粒體UCP2蛋白發(fā)揮作用。