三七真空冷凍干燥工藝優(yōu)化及對(duì)活性成分影響的研究

劉勝男， 王承瀟， 楊 野， 楊曉艷， 韓 偉， 崔秀明,3

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，制藥工程與過(guò)程化學(xué)教育部工程研究中心，上海 200237；3.云南省三七重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500）

三七 （Panax notogiseng）為五加科人參屬植物[1]，主產(chǎn)于云南、廣西等省。三七總皂苷[2]（Panax notoginsengSaponins , PNS）和三七素為三七中的主要活性成分。PNS 約占三七總質(zhì)量的6%～10%，具有良好的止血功效，能明顯縮短出血和凝血時(shí)間，促進(jìn)人體紅細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)，還具有明顯補(bǔ)血功效，并能顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬率，提高血液中淋巴細(xì)胞比值，具有活血化瘀、祛瘀生新的療效，主要用于心腦血管疾病的治療。三七素[3]又稱三七氨酸、田七氨酸，是一種水溶性非蛋白氨基酸，具有較強(qiáng)的止血、凝血及神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用。

本文中真空冷凍干燥的干燥方式在凍結(jié)狀態(tài)下完成，因而樣品切片的物理結(jié)構(gòu)及分子結(jié)構(gòu)變化較小，組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)能被較好保存；此外真空條件使樣品隔絕空氣，更加有效地保持了原料的色澤，有效成分品質(zhì)顯著提升，樣品外觀品質(zhì)較好[4]。真空冷凍干燥機(jī)的折舊率較高，加工成本的主要影響因素為耗電量。在真空冷凍干燥過(guò)程中，真空壓強(qiáng)、隔板溫度等因素以及樣品性質(zhì)均會(huì)影響三七活性成分的品質(zhì)和質(zhì)量。

本文系統(tǒng)研究了三七切片厚度、干燥機(jī)真空壓強(qiáng)及隔板溫度對(duì)PNS 和三七素兩種化學(xué)成分的影響，并進(jìn)行工藝優(yōu)化，得出最佳工藝條件，以此為三七藥材的加工提供技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

SCIENTZ-10ND 型真空冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自寧波新芝生物科技股份有限公司；Aglient 1260 型高效液相色譜儀，購(gòu)自安捷倫科技有限公司；梅特勒AL-104型電子天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ5200E 型超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；TU-1900 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3K15-高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Sigma 公司；S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，購(gòu)自日本日立公司；WFQ-510A 型傅里葉紅外變換光譜儀，購(gòu)自北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；DGG-9123AD 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SB-1100 型電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海愛(ài)朗儀器有限公司；UPT-I-20T型優(yōu)普系列超純水器，購(gòu)自成都超純科技有限公司。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用材料選取三年生的新鮮三七，17.59～21.23 g/個(gè)（除剪口），購(gòu)于云南文山，經(jīng)昆明理工大學(xué)楊野教授鑒定為五加科植物三七的干燥根莖。

1.3 試劑

三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào):138902)，人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):140509)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):140651)，人參皂苷Rd 對(duì)照品(批號(hào):140302)，人參皂苷Re 對(duì)照品(批號(hào):140285)，三七素對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純，均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.4 樣品處理方法

1.4.1 工藝流程 樣品處理工藝流程為：取適量新鮮三七清洗其表面雜質(zhì)→切片→稱重→均勻平鋪于物料盤(pán)上→進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.4.2 真空冷凍干燥工藝的單因素試驗(yàn) 選取切片厚度（3、5、7、9 mm）、隔板溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、真空壓強(qiáng)（30、40、50、60、70、80 Pa）3 個(gè)因素，在不同干燥時(shí)間內(nèi)測(cè)定PNS 及三七素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化。

1.4.3 真空冷凍干燥工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)三七冷凍干燥工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(CCD)的方法，以隔板溫度(A)和真空壓強(qiáng)(B)為影響因子，PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(T1)、三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(T2)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)兩因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，CCD 因素與水平如表1 所示。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Central composite design factor and level

1.4.4 滿意度函數(shù) 采用滿意度函數(shù)[5]同時(shí)考察PNS 及三七素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。每一個(gè)考察指標(biāo)（響應(yīng)值）均按下列方程式轉(zhuǎn)化為量綱為一的期望值，滿意度函數(shù)的平衡尺度（d）范圍為0～1，d=0 說(shuō)明響應(yīng)值

表2 凍干三七的考察指標(biāo)和最低期望響應(yīng)值、最高期望響應(yīng)值及權(quán)重值Table 2 Investigation index, minimum expected response value,maximum expected response value and weighted value of freeze-drying panax notoginseng

1.5 指標(biāo)測(cè)定

回歸方程表明PNS 在100～1 000 μg/mL下線性關(guān)系良好。精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為4.30%、2.97%、3.62%、4.18%、1.96%；重復(fù)性RSD 值分別為2.73%、1.96%、1.87%、2.24%、2.28%。結(jié)果表明該方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

1.5.2 三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 采用高效液相法測(cè)定

三七中三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]，參考課題組前期工作[8]，色譜條件：分析柱 Welchrom C18(4.6 mm × 250 mm × 5 μm)，以水-甲醇(體積比為95∶5)作為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，樣品進(jìn)樣體積20 μL，測(cè)得三七素的回歸方程：

方程表明三七素在50～500 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好，并測(cè)得精密度RSD 值為0.78% (n=6)；重復(fù)性RSD 值為3.58%(n=5)，穩(wěn)定性RSD 值為0.94%。結(jié)果表明該方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同切片厚度對(duì)三七活性成分的影響

真空冷凍干燥過(guò)程中，PNS、三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨切片厚度（真空壓強(qiáng)及隔板溫度一定）變化的規(guī)律見(jiàn)表3。由表可知，PNS 和三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著切片厚度的增加呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，兩者均在切片厚度為5 mm 時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)最大值，分別為9.084% ±0.487%、1.872%±0.001%。因此，首先固定切片厚度為5 mm，再進(jìn)行后續(xù)的干燥條件考察。

表3 切片厚度對(duì)三七主要成分的影響Table 3 Influence of slice thickness on the main constituent ofPanax notoginseng

2.2 不同干燥條件對(duì)三七主要成分的影響

2.2.1 隔板溫度對(duì)三七活性成分的影響 圖1 示出了固定切片厚度為5 mm、真空壓強(qiáng)為55 Pa 時(shí)，在不同隔板溫度下三七中有效成分的變化規(guī)律。由圖可知，PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著溫度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)最大值，為8.532%。由圖1（b）可知，三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨隔板溫度升高同樣呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)隔板溫度為40 ℃時(shí)，三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)最高值，為1.872%。

2.2.2 真空壓強(qiáng)對(duì)三七活性成分的影響 圖2 示出了當(dāng)固定切片厚度為5 mm、隔板溫度為45 ℃時(shí)，在不同真空壓強(qiáng)下三七中有效成分的變化規(guī)律。由圖可知，真空壓強(qiáng)為30～60 Pa 時(shí)，隨著壓強(qiáng)的增大，PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)也呈逐漸上升的趨勢(shì)；當(dāng)壓強(qiáng)為60 Pa時(shí)，PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)最大值，為9.743%；當(dāng)壓強(qiáng)為50 Pa 時(shí)，三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)出現(xiàn)最大值，為1.815%。綜合可得，當(dāng)壓強(qiáng)在50 ～60 Pa 范圍內(nèi)，三七活性成分相對(duì)較高，因此選擇該區(qū)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由上述單因素考察結(jié)果可知，干燥工藝各參數(shù)對(duì)三七中兩種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有較大影響，且各指標(biāo)隨考察因素（真空壓強(qiáng)、隔板溫度）的變化規(guī)律也不盡相同。因此不能以單一考察指標(biāo)代表三七整體品質(zhì)，可采用響應(yīng)面優(yōu)化的方法綜合、系統(tǒng)地反映干燥工藝對(duì)三七整體品質(zhì)因素的影響。

2.3 不同水平下三七活性成分變化曲線

分別將溫度和真空壓強(qiáng)水平（Level）取值?1.0、0、1.0，代入方程（1）和（2），繪制兩個(gè)因素對(duì)PNS 和三七素兩個(gè)指標(biāo)的交互作用曲線，如圖3、圖4 所示。由圖3(a)可知，溫度-PNS 曲線在溫度考察范圍內(nèi)呈現(xiàn)較大的上升趨勢(shì)。不同的真空壓強(qiáng)水平下，溫度-PNS 曲線的形狀特征改變較小。另一方面，由圖3(b)可知，隨著隔板溫度水平的上升，壓強(qiáng)-PNS 曲線逐漸上移，且總體形狀保持不變。由此可知，對(duì)于PNS 而言，隔板溫度是干燥過(guò)程中影響其質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的主要因素。

圖1 三七活性成分隨隔板溫度的變化曲線Fig.1 Curve of the active constituent of Panax notoginseng varying with the clapboard temperature

由圖4(a)可知，當(dāng)真空壓強(qiáng)水平為?1.0 時(shí)，三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著隔板溫度水平的升高逐漸下降；當(dāng)真空壓強(qiáng)水平為0 和1.0 時(shí)，三七素-隔板溫度曲線形狀發(fā)生了改變，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。值得注意的是，在隔板溫度水平較低的時(shí)候，真空壓強(qiáng)水平對(duì)三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不大；而當(dāng)隔板溫度水平較高的時(shí)候，真空壓強(qiáng)水平的變化將顯著影響三七素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，表明此時(shí)真空壓強(qiáng)和隔板溫度之間存在顯著的相互作用。由圖4(b)可知，在隔板溫度水平為?1.0 和0 的時(shí)候，真空壓強(qiáng)-三七素曲線較為平緩，表明此時(shí)三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)主要是受溫度的影響。而當(dāng)溫度隔板水平為1.0 的時(shí)候，真空壓強(qiáng)-三七素曲線呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，表明在該溫度水平下三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)受真空壓強(qiáng)的影響較大。而3 條曲線呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，表明了溫度和壓強(qiáng)之間顯著的交互作用。

2.4 CCD 試驗(yàn)結(jié)果分析及滿意度分析

CCD 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，利用Design Expert 11 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立以PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(T1)、三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(T2)和總體滿意度D為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（表5～7）。

根據(jù)CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行滿意度分析。取表2中的y1l=6.5，y1h= 10.1，y2l=1.0，y2h=1.9。

圖2 三七活性成分隨真空壓強(qiáng)的變化曲線Fig.2 Curve of active constituent of Panax notoginseng varying with vacuum pressure

圖3 不同水平條件對(duì)PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect of different level conditions on the mass content of PNS

圖4 不同水平條件對(duì)三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effects of different level conditions on the mass content of Dencichine

表4 CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of CCD design

由表6 方差分析所示，該回歸模型極顯著（P＜0.01），說(shuō)明三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與各變量之間存在顯著的線性相關(guān)，可以利用模型預(yù)測(cè)響應(yīng)值三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與變量之間的關(guān)系。其中一次項(xiàng)A-PRE 隔板溫度不顯著，說(shuō)明A-PRE對(duì)三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒(méi)有顯著影響；B-TEM 隔板溫度顯著，交叉項(xiàng)AB顯著，說(shuō)明隔板溫度和真空壓強(qiáng)對(duì)三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有顯著交叉影響。二次項(xiàng)A2、B2顯著。

由表5、表6 可知，模型極顯著(P＜0.01)，失擬值不顯著(P＞0.05)，說(shuō)明該回歸方程的擬合效果好，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案具有可操作性。A、B兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值T1的影響效果大小順序?yàn)椋篈＞B、對(duì)響應(yīng)值T2的影響效果大小順序?yàn)椋築＞A。

表5 T1 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of T1 regression model

表6 T2 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of T2 regression model

表7 以總滿意度D 為響應(yīng)值的回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression with overall desirability D as response value

2.4.3 以總體滿意度D為響應(yīng)值的方差及響應(yīng)面分析 為保證PNS 和三七素在干燥過(guò)程中最大程度保留，采用響應(yīng)面和等高線對(duì)總體滿意度D進(jìn)行分析[10]?？傮w滿意度D與真空壓強(qiáng)(A)和隔板溫度(B)的響應(yīng)面分析結(jié)果見(jiàn)圖5 所示。

交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可根據(jù)等高線的形狀體現(xiàn)，圓形表示兩因素交互作用較強(qiáng)。由圖5(a)、5(b)可看出，壓強(qiáng)和溫度對(duì)總滿意度的影響存在交互作用，且隨著真空壓強(qiáng)、隔板溫度水平的增加，總體滿意度D呈先增大后減小的趨勢(shì)。

總體滿意度D與真空壓強(qiáng)（A）和隔板溫度（B）的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

由表7 方差分析所示，該回歸模型極顯著（P＜0.01），可預(yù)測(cè)響應(yīng)值總體滿意度與變量之間的關(guān)系。將多響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為單響應(yīng)值即總體滿意度D，根據(jù)軟件Design Expert 11 的分析結(jié)果，利用響應(yīng)面法求解D，得到理論最大總體滿意度為4.353，代入式（12）～（14）中，求得此時(shí)對(duì)應(yīng)的壓強(qiáng)為56.9 Pa，溫度為45.2 ℃，相應(yīng)的PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.77%，三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.76%。由表4 所示，以PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大的響應(yīng)值10.066%，所對(duì)應(yīng)的三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.026%進(jìn)行滿意度計(jì)算，此時(shí)滿意度為0.145；以三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大的響應(yīng)值1.777%，所對(duì)應(yīng)的PNS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.506%進(jìn)行滿意度計(jì)算，此時(shí)滿意度為4.141，均低于最大總體滿意度4.353。表明滿意度函數(shù)法能在多響應(yīng)值之間取得均衡，適用于多響應(yīng)值優(yōu)化。

圖5 總體滿意度D 響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of overall desirability D

在最優(yōu)條件下平行重復(fù)3 次試驗(yàn)，得出PNS 和三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)的總體滿意度D值分別為4.315、4.264 和4.249 (平均值4.276)，與預(yù)測(cè)D值較為接近，證明該優(yōu)化方法穩(wěn)定可信。

2.5 SEM 表征

在優(yōu)化工藝下制備冷凍干燥三七樣品，并采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)不同干燥方式的三七及鮮三七(Fresh Samples, FS)的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖6 所示。由圖可知，F(xiàn)S 的SEM 圖可見(jiàn)清晰的組織結(jié)構(gòu)和排列有序的細(xì)胞。自然干燥(Room Temperature Drying, RTD)樣品出現(xiàn)了一定程度的自然氧化導(dǎo)致的顏色加深。熱風(fēng)干燥(Hot Air Drying, HD)樣品三七切片內(nèi)部出現(xiàn)了嚴(yán)重組織收縮變形和細(xì)胞塌陷，宏觀表現(xiàn)為較嚴(yán)重的氧化變色以及皺縮變形，樣品硬度最大。而真空冷凍干燥(Freeze-drying in Vaccum,FD)樣品由于在相對(duì)溫和的干燥條件下操作，樣品內(nèi)部細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有或發(fā)生了最小程度的熱損傷，且未觀察到較大程度的組織收縮和細(xì)胞塌陷，所以內(nèi)部細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)得以完好保存。

2.6 物料色度分析

比較不同干燥方式的樣品與新鮮樣品的色度值，樣品色度分析結(jié)果通過(guò)色度儀直接測(cè)出，見(jiàn)表8。

圖6 不同干燥方式下的三七樣品SEM 圖(100 kPa)Fig.6 SEM diagrams of Panax notoginseng samples dried in different ways (100 kPa)

由表8 可知，在不同干燥樣品的色度測(cè)定結(jié)果中，HD、RTD 及FD 樣品的亮度均顯著高于FS 樣品（P＜0.05），且三者之間亮度大小順序?yàn)镕D＞RTD＞HD，這與樣品在干燥過(guò)程中被氧化而發(fā)生褐變的程度呈正相關(guān)。紅綠值的大小順序?yàn)镕D＞HD＞FS＞RTD，黃藍(lán)值的大小順序?yàn)镠D＜FD＜RTD＜FS。干燥后的FD樣品與FS 樣品的總色差差異極顯著（P＜0.01），色度、紅綠值和黃藍(lán)值都遠(yuǎn)大于FS 樣品，這是由于三七切片的干燥在凍結(jié)狀態(tài)下完成，其物理結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)變化極小，組織結(jié)構(gòu)和外觀形態(tài)被較好地保存，說(shuō)明采用真空冷凍干燥的三七切片樣品的感官品質(zhì)最佳。

表8 不同干燥方式下的樣品色度分析Table 8 Chromaticity analysis samples under different drying methods

3 結(jié)束語(yǔ)

PNS 與三七素均為三七的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要分布在胞漿及細(xì)胞質(zhì)等液體環(huán)境中，隨著干燥環(huán)境的變化，細(xì)胞中液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)和PNS 成分逐漸減少，導(dǎo)致PNS 活性成分降低；而三七素是一種水溶性非蛋白氨基酸[11]，在相對(duì)溫度較高的條件下，氨基酸成分易受到破壞。真空冷凍干燥過(guò)程是在低溫且基本隔絕空氣的條件下進(jìn)行，能夠有效地保護(hù)三七活性成分、保持三七的色澤、藥性和藥味，同時(shí)可避免細(xì)胞的機(jī)械破壞，減少細(xì)胞內(nèi)成分的損失[12]。本文研究結(jié)果表明，在真空干燥過(guò)程中，隔板溫度和真空壓強(qiáng)是影響PNS 和三七素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的主要因素。通過(guò)Design Expert11 軟件并結(jié)合滿意度函數(shù)對(duì)真空冷凍干燥工藝進(jìn)行綜合分析，得出最佳工藝為隔板溫度45.2 ℃、真空壓強(qiáng)56.9 Pa。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，該條件下PNS 及三七素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到9.77%、1.76%，與預(yù)測(cè)值相符，優(yōu)化效果明顯。該研究能夠?yàn)槿咚幉牡恼婵绽鋬龈稍锕に囂峁├碚搮⒖迹瑫r(shí)對(duì)三七新型飲片的開(kāi)發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。