高效液相色譜法測(cè)定不同開(kāi)花時(shí)期大馬士革III玫瑰（Rosa damascene tyigintipetala）花青素種類及含量

劉雷, 陳黎, 李華, 黃怡, 牟秋雨, 緱蕓莎, 李志鵬

1. 綿陽(yáng)師范學(xué)院 森林與草原防災(zāi)減災(zāi)工程研究中心，四川 綿陽(yáng) 621000；

2. 宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 宜賓 644000；

3. 綿陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000

大馬士革玫瑰（Rosa damasceneMiller）屬薔薇科、薔薇屬的植物，所產(chǎn)玫瑰精油純正、香氣濃郁、質(zhì)量穩(wěn)定，符合ISO9842國(guó)際質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是世界上最好的玫瑰精油生產(chǎn)品種之一，精油價(jià)格高于黃金數(shù)倍，被譽(yù)為“液體黃金”，在化妝品、食品、藥品及保健品等領(lǐng)域具有廣泛用途[1-2]。大馬士革Ⅲ玫瑰（Rosa damascene tyigintipetala）是從大馬士革玫瑰中、篩選所得優(yōu)良專用油用玫瑰品種，既具有大馬士革玫瑰的優(yōu)點(diǎn)，又具有抗病力強(qiáng)，適應(yīng)性廣，產(chǎn)花量和出油率高的特點(diǎn)，廣泛用于栽培生產(chǎn)。關(guān)于大馬士革玫瑰，先前的研究主要集中在該品種的扦插育苗[3-5]、組培條件的篩選和優(yōu)化以及無(wú)性繁殖體系的建立[6-7]、揮發(fā)油的提取及組分的分離和鑒定[8-9]。

花青素是一類廣泛在于石竹類屬、大麗花屬、薔薇屬及金魚草屬等植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，具有抗氧化、抗突變等多種生物學(xué)功能，其中廣泛分布且常見(jiàn)的為6種，即天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛色素和錦葵色素[10-11]。花青素在自然界中主要以糖苷化和?；绞酱嬖冢煌慕Y(jié)合方式形成種類復(fù)雜、品種眾多的花色苷?；ㄉ憩F(xiàn)的生化機(jī)制是由于花瓣內(nèi)細(xì)胞所含的類黃酮物質(zhì)（花青素）、胡蘿卜素和生物堿的數(shù)量與含量的差異[12]。由于花色苷的種類眾多，要建立全部花色苷的檢測(cè)方法十分困難，但是將花色苷水解后形成花青素單體后，進(jìn)行檢測(cè)，則變得簡(jiǎn)單可行[13]。

大馬士革III玫瑰花青素種類和含量測(cè)定尚未有相關(guān)研究報(bào)的、呈色機(jī)理更是未知。本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸和甲醇作為溶劑超聲提取法對(duì)花青苷進(jìn)行提取，沸水浴法對(duì)花青苷水解，高效液相色譜法對(duì)大馬士革III玫瑰蕾期、初開(kāi)期、盛開(kāi)期和盛開(kāi)末期4個(gè)不同開(kāi)花時(shí)期6種主要花青素（飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素、矮牽牛色素）種類及含量進(jìn)行分析，擬建立大馬士革III玫瑰和其他植物源性主要花青素有效、穩(wěn)定的測(cè)定方法，分析大馬士革III玫瑰不同開(kāi)花時(shí)期花青素的種類和含量，為大馬士革III玫瑰的呈色機(jī)理研究以及花色育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1 260高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent 公司)，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）, Arium?comfort純水儀（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）,電子分析天平(德國(guó)Sartorius bsa224s-cw型萬(wàn)分之一)，KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司），水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

飛燕草色素純物質(zhì)Extrasynthese，矢車菊色素純物質(zhì)Edqm，天竺葵色素純物質(zhì)Extrasynthese，芍藥素純物質(zhì)Extrasynthese，錦葵色素純物質(zhì)ChromaDex，矮牽牛色素純物質(zhì)Extrasynthese。甲醇（色譜純，北京迪科馬科技有限公司），甲酸、無(wú)水乙醇和鹽酸（分析純，成都市科龍化工試劑廠），水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)材料

從四川省綿陽(yáng)市游仙區(qū)柏林鎮(zhèn)萬(wàn)山柏林玫瑰專業(yè)合作社取回的大馬士革III玫瑰材料，經(jīng)綿陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院羅明華教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物大馬士革Ⅲ玫瑰（Rosa damascenetyigintipetala）。2017年 5月在晴天的上午，選取4個(gè)開(kāi)花時(shí)期（蕾期、初開(kāi)期、盛開(kāi)期和盛開(kāi)末期）的花蕾作為研究材料，來(lái)源于生長(zhǎng)勢(shì)一致，花蕾均勻，花色一致的4年生植株的4個(gè)單株，每株分散選取10朵花，將每個(gè)單株10朵花的花瓣全部取下，3次生物學(xué)重復(fù)，用封口袋收集后放置冰盒中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將200 g玫瑰花瓣樣品分次用勻漿機(jī)勻漿，勻漿后樣品在-18 ℃條件下保存。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g試樣至50 mL具塞比色管中，加入提取液（無(wú)水乙醇、水和鹽酸比例為2∶1∶1）定容至刻度，搖勻，靜置1 min，超聲提取30 min。超聲提取后，于沸水浴中水解1 h，冷卻至室溫，用提取液再次定容至50 mL。靜置后取上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液上機(jī)分析，用峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。

2.2 單標(biāo)儲(chǔ)備液制備

分別稱取一定質(zhì)量飛燕草色素、矢車菊色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素、矮牽牛色素標(biāo)準(zhǔn)品，用10%鹽酸甲醇溶液溶解定容，配制成0.5～1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，-18 ℃遮光保存。

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

把單標(biāo)儲(chǔ)備液取用10%鹽酸甲醇溶液最終配制為50.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。每次將此混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。

2.4 測(cè)定條件

色 譜 柱 ： Agilent ZORBAX SB-C18（ 5 μm）4.6 mm×250 mm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：1%甲酸水溶液：1%甲酸乙腈溶液，流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)器：DAD，波長(zhǎng)：530 nm，進(jìn)樣量：20.0 μL，水相濾膜0.45 μm。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

2.5 儀器檢出限、方法檢出限、定量限

色譜的儀器檢出限與儀器噪聲和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率有關(guān)，噪聲為峰高（LU），標(biāo)準(zhǔn)曲線為濃度和峰高的線性關(guān)系，具體公式如下：儀器檢出限=3×儀器噪聲÷標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；方法檢出限=儀器檢出限×50÷1.00（50：定容體積；1.00：稱樣量）；定量線=3×方法檢出限；利用2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖計(jì)算噪聲（ASTM），設(shè)定噪聲計(jì)算時(shí)間為8～10 min。利用標(biāo)準(zhǔn)工作液的峰高得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=Ax+B，其中y為響應(yīng)值，x為濃度，A為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，B為常數(shù)項(xiàng)。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab. 1 Gradient elution conditions of the flow phase

2.6 線性關(guān)系考察

將0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液按 2.4 項(xiàng)的色譜條件測(cè)定飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6種花青素的峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品含量(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(x)，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.7 回收率及重復(fù)性試驗(yàn)

回收率及重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取空白樣品3份（已測(cè)定不含這6種花青素的玫瑰花），每份約1.00 g，按50 mg·kg-1的含量進(jìn)行加標(biāo)，按2.1項(xiàng)進(jìn)行定量并計(jì)算加樣回收率。

2.8 樣品含量測(cè)定

取供試樣品適量，按上述方法測(cè)定不同開(kāi)花時(shí)期大馬士革III玫瑰花中飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6種花青素的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 儀器檢出限、方法檢出限、定量限

稱樣量為1.000 0 g，定容體積為50 mL，飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素、錦葵色素等6中花青素的方法檢出限為0.11、0.13、0.18、0.14、0.10 和 0.10 mg·kg-1；定量限為 0.33、0.39、0.57、0.42、0.30 和 0.30 mg·kg-1。

3.2 線性結(jié)果

按2.6的方法測(cè)試和計(jì)算得回歸方程如下：飛燕草色素：Y=99.27X-2.47（r=0.9998）；矢車菊色素：Y=125.78X-4.70（r=0.9998）；矮牽牛色素：Y=100.79X-3.78（r=0.9995）；天竺葵色素：Y=109.37X-1.10（ r=0.9999）； 芍 藥 素 ： Y=119.53X-2.09（ r=0.9999）；錦葵色素：Y=107.12X-3.19（r=0.9999）。以上結(jié)果表明，6種花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性均較好，能夠滿足測(cè)試需要。

3.3 回收率試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，6種花青素的加標(biāo)回收率在63.8%～98.3%之間，平均加標(biāo)回收率在64.2%～96.6%之間，加標(biāo)回收的RSD分別為1.63%、1.87%、0.69%、0.34%、0.85%、0.56%，結(jié)果表明分析方法準(zhǔn)確性良好。方法學(xué)考察結(jié)果表明該分析方法能夠滿足6種花青素的定量分析要求。

表2 6種花青素的加樣回收率Tab. 2 Recovery rate of 6 anthocyanins from samples

3.4 花青素的種類和含量

高效液相色譜法分析結(jié)果表明，大馬士革III玫瑰4個(gè)不同開(kāi)花時(shí)期（蕾期、初開(kāi)期、盛開(kāi)期和盛開(kāi)末期）可以檢測(cè)出常見(jiàn)6種花青素中的兩種，即矢車菊色素和天竺葵色素，而飛燕草色素、矮牽牛 色素、芍藥素和錦葵色素未能檢出（見(jiàn)表3）。

表3 不同開(kāi)花時(shí)期大馬士革III玫瑰花青素組分含量方差分析結(jié)果Tab. 3 Variance analysis of anthocyanin contents from Rosa damascene tyigintipetala at different flowering periods

方差分析結(jié)果表明不同開(kāi)花時(shí)期大馬士革III玫瑰矢車菊色素含量差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01），且矢車菊色素由蕾期開(kāi)始往后，其含量逐漸降低，LSD多重比較結(jié)果顯示，在4個(gè)不同開(kāi)花時(shí)期矢車菊色素含量?jī)蓛砷g差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

天竺葵色素在初開(kāi)期含量最高，蕾期和盛開(kāi)期含量次之，盛開(kāi)末期含量最低。方差分析結(jié)果表明不同開(kāi)花時(shí)期大馬士革III玫瑰天竺葵色素含量差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01），LSD多重比較結(jié)果表明，天竺葵色素在蕾期和初開(kāi)期含量差異不顯著（P<0.01），與盛開(kāi)期和盛開(kāi)末期相比含量差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），盛開(kāi)期和盛開(kāi)末期相比，天竺葵色素含量差異也達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

相關(guān)分析表明：檢測(cè)出來(lái)的兩種花青素（矢車菊色素、天竺葵色素）不同開(kāi)花時(shí)期含量相關(guān)性不顯著。

4 討論與結(jié)論

4.1 HPLC法同時(shí)測(cè)定6種主要花青素方法的建立

目前，對(duì)植物花青素成分的提取的研究，主要采用甲醇熱回流法，該方法具有能耗大，效率低，耗時(shí)，提取溫度高等[14]；其次為酶解提取，該法價(jià)格昂貴，對(duì)pH值、溫度和作用時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件要求高，可用于提取的梅種類不多，限制了該工藝的推廣和發(fā)展[15]。本試驗(yàn)以植物源性食品中主要花青素成分（飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素）為指標(biāo)成分，采用鹽酸和甲醇作為溶劑超聲提取的方法提取目標(biāo)成分，超聲處理能夠加快花色苷的提取，使用強(qiáng)酸超聲提取后可直接進(jìn)行水解，避免了萃取過(guò)程中的損失，目標(biāo)成分的提取效率較高，分離度較好。六種主要花青素測(cè)定的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、儀器檢出限、方法檢出限、定量限、精密度試驗(yàn)RSD值、回收率試驗(yàn)RSD值、重復(fù)性試驗(yàn)RSD值等均達(dá)到測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)要求。該方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，研究結(jié)果表明應(yīng)用新建立的HPLC法，可以滿足大馬士革Ⅲ玫瑰樣品中和其他植物源性六類主要花青素成分分析測(cè)定要求。

4.2 花青素含量變化

本研究發(fā)現(xiàn)大馬士革Ⅲ玫瑰4個(gè)不同開(kāi)花時(shí)期檢出了矢車菊色素和天竺葵色素兩種花青素，并且矢車菊色素含量在不同花期均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在開(kāi)花過(guò)程中此兩類花青素含量均隨開(kāi)花過(guò)程和花瓣褪色而降低，由此可以初步判定這兩種花青素相應(yīng)的糖苷是決定大馬士革Ⅲ玫瑰花色的主要成分，開(kāi)花過(guò)程中花色變化主要和矢車菊色素和天竺葵色素兩種花青素相應(yīng)的糖苷含量變化相關(guān)。兩種花青素在初開(kāi)期之前完成積累，隨著花朵開(kāi)放不再合成，只是逐步降解?；ㄇ嘬针S花朵開(kāi)放含量降低，可能是因?yàn)殡S著花朵的開(kāi)放，花瓣逐漸展開(kāi)，花瓣受光面積增大，光照影響了花青苷的穩(wěn)定性，使其逐步降解，從而導(dǎo)致含量逐步降低。

4.3 花色育種

植物花色是觀賞植物重要的性狀之一，花色改良一直是園藝工作者重要的育種目標(biāo)之一[16]。植物的花色不僅在吸引傳粉者、為植物的授粉和繁衍后代方面起到重要作用，也為植物提供了五色斑斕的色彩，具有重要美學(xué)價(jià)值[17-18]。月季（Rosa chinenis）、玫瑰（Rosa rugosa）和野薔薇（Rosa multiflora）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（RosaL.）的3個(gè)物種。與大馬士革Ⅲ玫瑰同屬的月季花色豐富，包括紅、朱紅、粉、橙白、藍(lán)紫、復(fù)色、混色各種色系，可以形成一個(gè)連接不斷的環(huán)形色譜圖，是開(kāi)展花色研究的良好材料。相關(guān)的研究也表明，月季品種花青苷種類以天竺葵素和矢車菊素相應(yīng)的糖苷為主，有些品種也富含芍藥素糖苷[19-20]，與本研究的結(jié)果一致。后續(xù)的研究將圍繞大馬士革Ⅲ及其相關(guān)近緣月季品種的花色表型及其色素分析開(kāi)展，同時(shí)研究花青苷代謝途徑的分子調(diào)控機(jī)理，這些工作對(duì)于準(zhǔn)確反映薔薇屬植物花色多樣性及花青苷的分布特點(diǎn)具有重要意義，同時(shí)也為探討大馬士革玫瑰花色的呈色機(jī)理和花色育種提供參考。