福建黃兔肌纖維性狀及Myh6基因表達(dá)水平分析

穆 琳，王文洲，趙博昊，胡帥帥，趙 斌，陳 陽(yáng)，吳信生

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

福建黃兔肌纖維性狀及Myh6基因表達(dá)水平分析

穆 琳，王文洲，趙博昊，胡帥帥，趙 斌，陳 陽(yáng)，吳信生*

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009）

選取我國(guó)地方品種福建黃兔為研究對(duì)象，利用冰凍切片技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段福建黃兔背肌和腿肌的肌纖維性狀進(jìn)行研究，通過(guò)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分析在肌肉發(fā)育過(guò)程中起重要作用的Myh6基因在福建黃兔不同發(fā)育階段表達(dá)水平的差異，并與肌纖維性狀進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示：2、4、6、8、10和12周齡福建黃兔的白肌纖維密度均顯著大于紅肌纖維和中間型肌纖維，白肌纖維的面積顯著高于紅肌纖維，長(zhǎng)徑和短徑的大小排列為白肌纖維＞中間型肌纖維＞紅肌纖維，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在6周齡前，背肌和腿肌中各類肌纖維長(zhǎng)徑、短徑和面積呈顯著增大的趨勢(shì)，而6周齡后增大趨勢(shì)逐漸變緩；Myh6基因在公母兔背部和腿部的表達(dá)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中母兔在4周齡表達(dá)量最高，公兔在6周齡表達(dá)量最高；Myh6基因的表達(dá)量與肌纖維面積、長(zhǎng)徑和短徑的變化一致。表明Myh6基因與肌纖維類型和肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

福建黃兔；肌纖維；Myh6基因；表達(dá)水平

Summary With growing demands for the diversity and quality of meat,rabbit meat is more and more popular with its special flavor.The traits ofmuscle fibers have a directeffecton the quality of meat,and the number,size,density,and type of muscle fibers are closely related to the meat flavor.However,recent studies on genes related to meat quality of rabbit are quite few,so the formation mechanism ofthe edibility characteristic ofthe muscle fibers is stillunclear.Myh6,a member ofthe myosin heavy chain family,plays an important role in the development of muscles.What’s more,Myh6 is a marker gene in cardiac developmentwhich promotes the expansion ofventricularmyocardialcell.

In order to clarify the relationship of Myh6 and muscle fiber traits,correlation analysis was used to study the expression level of Myh6 in rabbit muscle fibers of longissimus dorsi muscle and leg muscle with different ages,which could also provide theoretical basis for some improvement in rabbit meat.In this study,Fujian yellow rabbits were used as experimental animals, and their myofiber traits of longissimus dorsi muscle and leg muscles at different development stages were evaluated by a frozen section technique.Meanwhile,expression levels of Myh6 gene of Fujian yellow rabbit at different development stages were analyzed by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).

The results showed that the density of white muscle fibers was significantly higher than that of red muscle fibers and intermediate muscle fibers at 2,4,6,8,10 and 12 weeks old;and the area of white muscle fibers was significantly greater than that of red muscle fibers.The descending order for the long and short diameters of muscle fibers of legs and backs was white muscle fibers,intermediate muscle fibers and red muscle fibers.The inverse relationship between the density and area of muscle fibers was that the density of muscle fibers decreased with the increase of muscle fiber area.The density of muscle fibers had an obviously decreasing trend from 2 to 6 weeks old.In the whole,with the age increasing,the density decreased but not significant.There was no significant difference between long and short diameters of muscle fibers,and both long and short diameters of the different muscle fibers increased gradually with the age increasing,although the trend was very obvious before 6 weeks old,butinsignificantafter 6 weeks old.

The results also showed that the expression level of Myh6 firstincreased and then decreased in longissimus dorsimuscles and leg muscles of bucks and does,which showed the highestexpression level at 4 weeks old in does and 6 weeks old in bucks. Furthermore,there is no difference in the change tendency between the expression levelof Myh 6 gene and the variation of area, long and short diameters of muscle fibers.Above all,it can be concluded that the development of muscle fibers is related to Myh6 gene.

肌球蛋白由多個(gè)高度保守的基因編碼，含有多種同工蛋白家族，在骨骼肌運(yùn)動(dòng)中主要起收縮作用。肌球蛋白分子由2條肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)和2對(duì)起調(diào)節(jié)作用的肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain,MyLC)組成。Myh6基因?qū)儆诩∏虻鞍字劓溂易濉Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，敲除Myh6基因的小鼠患有心肌衰竭與異常肥大癥[1]。Myh6基因表達(dá)下調(diào)可能引起心房間隔缺陷[2]。斑馬魚(yú)wea突變體由于干擾了斑馬魚(yú)Myh6基因的正常表達(dá)導(dǎo)致心房收縮缺陷[3]。Mef2轉(zhuǎn)錄因子缺失的果蠅在Myh6基因表達(dá)下調(diào)時(shí)出現(xiàn)肌球蛋白重鏈缺失的性狀[4]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選北京油雞肌肉發(fā)育相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)Myh6基因可能參與肌肉細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[5]。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室也利用表達(dá)譜芯片技術(shù)從新西蘭白兔和福建黃兔不同部位肌肉中篩選出差異表達(dá)的Myh6基因[6]，因此，推測(cè)其與家兔的骨骼肌發(fā)育密切相關(guān)。

福建黃兔是我國(guó)地方家兔優(yōu)良品種[7]，具有耐粗飼、繁殖性能好、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)與口感好、藥用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[8]，擁有“藥膳之兔”的美譽(yù)，被農(nóng)業(yè)部列入《國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》[9]。但目前關(guān)于福建黃兔肌肉發(fā)育的研究較少，其肌纖維性狀形成的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)更是鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)對(duì)比福建黃兔不同發(fā)育時(shí)期的肌纖維類型及Myh6基因的表達(dá)水平差異，分析Myh6基因與肌纖維性狀的相關(guān)性，旨在為福建黃兔肌肉發(fā)育遺傳學(xué)機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自飼養(yǎng)于江蘇省金陵種兔場(chǎng)的福建黃兔。隨機(jī)選取2、4、6、8、10、12周齡的公母兔各15只，取背最長(zhǎng)肌（以下簡(jiǎn)稱背?。┖秃笸葍?nèi)側(cè)?。垂伤念^肌，以下簡(jiǎn)稱腿?。┻m當(dāng)大小各2塊：一塊裝入10 mL管中，編號(hào)后迅速投入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室立即制作冰凍切片；另一塊放入1.5 mL指形管中，并迅速投入到液氮里，最后置于－70℃冰箱中保存，用于總RNA提取。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank公布的家兔基因的mRNA序列，利用NCBI網(wǎng)站Primer-BLAST在線引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)得到Myh6基因和內(nèi)參基因GAPDH的熒光定量引物序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.1.3 主要試劑

磷酸緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、0.1%硝基四氮鹽和Trizol均購(gòu)買自美國(guó)Invitrogen公司；SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量試劑盒和無(wú)RNA酶水（RNase-free water）均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)測(cè)定

在恒溫冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行冰凍切片制作：將修好的樣品固定在涂抹了包埋劑的樣品托上，并保證肌纖維走向與樣品托垂直，同時(shí)做好標(biāo)記，切片厚度一般為5～10μm。利用琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH）染色法染色，封片后置于顯微鏡下選取合適的視野觀察測(cè)量，利用勵(lì)揚(yáng)萬(wàn)能視頻成像系統(tǒng)裝置和ScopePhoto軟件在10倍物鏡下拍照，每個(gè)樣品選取2個(gè)視野。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成

肌肉總RNA提取按Trizol提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，總RNA提取完成后用DNA酶（DNase）水處理以去除基因組DNA的污染，并用分光光度法檢測(cè)RNA的質(zhì)量，置于－20℃冰箱中保存。cDNA合成根據(jù)SuperRT cDNA試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，其中RNA模板2μL，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTMfirststrand cDNA synthesis kit）合成單鏈cDNA。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）采用SYBR Green I法進(jìn)行。將每個(gè)待測(cè)樣品的反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT）產(chǎn)物等體積混合，用混合樣（cDNA mix）進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，包括最佳退火溫度、引物濃度、模板濃度等，確定最佳反應(yīng)條件。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，利用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）分析在PCR過(guò)程中熒光信號(hào)值的變化，并獲取各樣品基因的CT值，采用2－ΔΔCT

法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；利用IPP專業(yè)圖像分析軟件分析冰凍切片的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)所有圖片中各類肌纖維的組織學(xué)特性。

表1 目的基因引物序列Table1 Primersequences ofthe targetgenes

圖1 8周齡公母兔背肌和腿肌的冰凍切片F(xiàn)ig.1 Frozen sections ofthe longissimus dorsimuscles and leg muscles ofbuck and doe at8 weeks old

2 結(jié)果與分析

2.1 福建黃兔背肌和腿肌纖維類型

利用冰凍切片技術(shù)分析2、4、6、8、10和12周齡福建公母黃兔背肌和腿肌的肌纖維類型，根據(jù)染色的深淺可判斷不同的肌纖維類型。以8周齡為例，染色最深的為紅肌纖維，染色最淺的為白肌纖維，染色中等的為中間型肌纖維（圖1）。

2.2 不同周齡福建黃兔肌纖維密度和面積變化趨勢(shì)

如圖2所示：隨著福建黃兔周齡的增加，肌纖維面積逐漸增加，肌纖維密度逐漸減??；在2～6周齡內(nèi)，肌纖維密度的下降趨勢(shì)明顯，但8～12周齡內(nèi)，下降趨勢(shì)越來(lái)越小，幾乎保持不變。因此，從整體來(lái)看，隨著周齡數(shù)的增加，肌纖維密度逐漸下降，但減小的趨勢(shì)越來(lái)越不明顯。

2.3 不同周齡福建黃兔肌纖維長(zhǎng)徑和短徑變化趨勢(shì)

如圖3所示，不同周齡福建黃兔背部和腿部肌纖維的長(zhǎng)徑和短徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但隨著周齡數(shù)的增大，各類肌纖維的長(zhǎng)徑和短徑逐漸變大，且在6周齡前變大的趨勢(shì)更明顯，6周齡之后增長(zhǎng)緩慢。

2.4 Myh6基因在福建黃兔背肌和腿肌中的表達(dá)水平

由圖4可知：隨著周齡的增大，Myh6基因在福建黃兔背肌和腿肌中的表達(dá)量都呈現(xiàn)出先增大再變小最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)；且Myh6基因在母兔背部和腿部中的表達(dá)量在4周齡時(shí)達(dá)到最大，而在公兔背部和腿部中的表達(dá)量在6周齡時(shí)最大，顯著高于其他幾個(gè)周齡(P＜0.05)；同時(shí)，Myh6基因在公兔腿肌中的表達(dá)量大于在母兔腿肌中的表達(dá)量。

結(jié)合肌纖維性狀的表型數(shù)據(jù)，即背肌和腿肌中各類肌纖維長(zhǎng)徑、短徑和面積在6周齡前增大趨勢(shì)明顯，6周齡后趨勢(shì)減緩，恰好與Myh6基因隨著周齡的變化規(guī)律一致。這表明Myh6基因可能在肌纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖2 不同周齡福建黃兔肌纖維密度和面積變化趨勢(shì)Fig.2 Changes ofthe density and area ofmuscle fiberin Fujian yellow rabbits atdifferentweek-ages

圖3 不同周齡福建黃兔肌纖維長(zhǎng)徑和短徑變化趨勢(shì)Fig.3 Changes ofthe long and shortdiameters ofmuscle fibers in Fujian yellow rabbits atdifferentweek-ages

圖4 福建黃兔背肌和腿肌中Myh6基因表達(dá)水平Fig.4 Myh6 expression level in the longissimus dorsi muscle and leg muscle of Fujian yellow rabbits

3 討論

肌纖維作為構(gòu)成肌肉的基本單位，其密度、直徑、面積是影響肌肉組織學(xué)特性和評(píng)定肉質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究以福建黃兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用冰凍切片技術(shù)對(duì)不同周齡的福建黃兔背部和腿部的肌纖維密度、面積、長(zhǎng)徑和短徑等性狀進(jìn)行了組織學(xué)測(cè)定與統(tǒng)計(jì)分析。陳寬維等[10]對(duì)我國(guó)7種不同遺傳背景肉雞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，白肌纖維直徑大于紅肌纖維和中間型纖維直徑，且其所占比例與肉的嫩度呈負(fù)相關(guān)。本研究在福建黃兔中測(cè)得的結(jié)果與此基本一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在6周齡前福建黃兔背肌和腿肌中各類肌纖維長(zhǎng)徑、短徑和面積增大的趨勢(shì)明顯，而6周齡后趨勢(shì)緩慢；這與俞榮林等[11]在新西蘭白兔骨骼肌中的研究結(jié)果一致。而福建黃兔的肌纖維密度隨著日齡數(shù)的增加而逐漸減小，這與陳巖鋒等[12]在閩西南黑兔中的研究結(jié)果類似。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選出了與家兔發(fā)育有關(guān)的肌球蛋白重鏈家族基因Myh6[6]。Myh6基因?qū)∪獍l(fā)育的影響至關(guān)重要，其表達(dá)下調(diào)可能會(huì)引起心房間隔缺陷[2]，出現(xiàn)肌球蛋白重鏈缺失[4]。目前，在小鼠、果蠅、斑馬魚(yú)等動(dòng)物中已對(duì)Myh6基因的功能進(jìn)行了研究，但在家兔或其他動(dòng)物組織肌肉中對(duì)該基因的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段的福建黃兔Myh6基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)隨著周齡數(shù)的增加，Myh6基因的表達(dá)量先變大后變小，最后趨于穩(wěn)定。將該定量結(jié)果與肌纖維組織學(xué)特性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析可以看出，當(dāng)肌肉的生長(zhǎng)速度較快時(shí)，Myh6基因的表達(dá)水平也較高。表明Myh6基因的表達(dá)量與肌纖維的類型即生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

隨著周齡的增加，福建黃兔背肌和腿肌中各類肌纖維的密度逐漸變小，而肌纖維面積、長(zhǎng)徑和短徑逐漸變大，且6周齡前變化趨勢(shì)明顯，之后變化趨緩。Myh 6基因在福建黃兔背肌和腿肌中的表達(dá)量都呈現(xiàn)出先增大后變小，最后趨于穩(wěn)定，與肌纖維面積、長(zhǎng)徑和短徑的變化趨勢(shì)相一致，說(shuō)明Myh6基因與肌纖維類型及生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，推測(cè)其在肌纖維的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

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MU Lin,WANG Wenzhou,ZHAO Bohao,HU Shuaishuai,ZHAO Bin,CHEN Yang,WU Xinsheng*
(Jiangsu Key Laboratory of Animal Genetics&Breeding and Molecular Design,College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,Jiangsu,China)

Fujian yellow rabbit;muscle fiber;Myh6 gene;expression level

S 829.1；S 886.9

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.05.111

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-44-1）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（PAPD 2014-134）。

吳信生(http://orcid.org/0000-0001-9871-0251)，E-mail:xswu@yzu.edu.cn

（Firstauthor）：穆琳（http://orcid.org/0000-0003-4121-2344），E-mail:mulin912@126.com

2016-05-11；接受日期(Accepted):2016-11-23