“烏葉”與“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期果肉的差異蛋白分析

蓋永紅，鐘燦鈺，林偉彬，沈璐岑，邱智敏，宋曉敏，黃榕輝,*

“烏葉”與“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期果肉的差異蛋白分析

蓋永紅1,2，鐘燦鈺1，林偉彬1，沈璐岑1，邱智敏3，宋曉敏1，黃榕輝1,*

（ 1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.甘肅省景泰縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測管理站，甘肅 景泰 730400；3.福建農(nóng)林大學林學院，福建 福州 350002）

為探索轉(zhuǎn)色期荔枝（Litchi chinensis Sonn.）品質(zhì)形成過程中蛋白質(zhì)的變化，應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析“烏葉”和“蘭竹”荔枝品種轉(zhuǎn)色期的差異蛋白質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)37 個2 倍以上的差異表達蛋白，32 個差異蛋白被成功鑒定。這些蛋白參與了糖類和能量代謝（21.9%）、抗性脅迫（9.4%）、蛋白質(zhì)代謝（15.6%）、細胞結(jié)構(gòu)形成（12.5%）、次級代謝（12.5%）、發(fā)育調(diào)控（12.5%）和未知功能途徑（15.6%）等代謝活動。與“蘭竹”荔枝相比，“烏葉”荔枝中與糖酵解途徑和能量代謝相關(guān)蛋白均下調(diào)表達，說明在轉(zhuǎn)色期，“烏葉”荔枝中糖類物質(zhì)降解速率較慢，有利于糖分的積累，形成高糖的品質(zhì)。同時，“烏葉”荔枝中與細胞結(jié)構(gòu)形成和抗性相關(guān)蛋白的上調(diào)表達，這有利于“烏葉”荔枝形成果肉質(zhì)地密集、耐貯藏的良好品質(zhì)。>

荔枝；果肉；差異蛋白；品質(zhì)

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）屬于常綠喬木，是南亞熱帶廣泛栽培的珍貴果樹之一，也是起源于我國的世界級水果，如今在印度、越南等世界各地均有栽培。荔枝果肉肉質(zhì)細膩多汁，酸甜入口，其補心安神、開胃益脾、補腦益身等功效使之成為上等的滋身健體補品。荔枝果實各部分組織的累加鮮質(zhì)量生長表現(xiàn)為典型的“S”型曲線[1-2]，其中假種皮的快速膨大生長期發(fā)生在花后67～88 d（持續(xù)約21 d），即果實發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)色期[3]。此外，李開拓[4]對荔枝的相關(guān)蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，無論是荔枝的果皮還是假種皮，在轉(zhuǎn)色期檢測和鑒定出的蛋白點數(shù)均最多。由以上可見，在荔枝果實發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)色期的生理代謝最為旺盛，酶活性較高，參與或調(diào)控細胞內(nèi)各種代謝途徑的酶的數(shù)量也居多。早期對果實轉(zhuǎn)色期的研究主要集中在葡萄[5]、蘋果[6]、草莓[7]等果實色澤變化規(guī)律方面，而目前對荔枝果實轉(zhuǎn)色期研究，除王家保[8]、胡桂兵[9]和Thakur[10]等對荔枝果皮及坐果機制有相關(guān)報道外，還未見其他相關(guān)報道?！盀跞~”和“蘭竹”荔枝是福建省最主要種植的品種，果肉多汁鮮美，色澤鮮紅誘人，品質(zhì)優(yōu)良。因此，本實驗應用凝膠蛋白質(zhì)組學技術(shù)，比較“烏葉”和“蘭竹”兩個荔枝品種轉(zhuǎn)色期果肉的差異蛋白，分析其在細胞內(nèi)代謝的作用功能，為揭示不同荔枝品種品質(zhì)形成的分子生理機制研究提供科學依據(jù)，為生產(chǎn)上提高荔枝果實的商品價值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為高糖含量的“烏葉”荔枝和低糖含量的“蘭竹”荔枝，于2014年7月采自福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所。選取盛花期后70 d，無病蟲害，大小及外觀形態(tài)一致的荔枝果實，采摘后剝?nèi)ス?，果肉置于液氮中冷凍后，保存于?0 ℃冰箱。每個實驗3 次生物學重復。

pH 4～7（線性）IPG（Immobilazed pH gradient）干膠條 美國GE公司；尿素、硫脲、3-（（3-膽酰胺丙基）二乙胺）-1-丙磺酸鹽（3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio) propanesulfonate，C HAPS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid e，PMSF）、Tris-飽和酚、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍美國Amresco公司；載體兩性電解質(zhì)、IPG Buffer、β-巰基乙醇、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、聚乙二醇單辛基苯基醚（Triton X- 100）美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；EttanTMIPGphorTM等電聚焦電泳儀、Ettan DALT-six雙向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）儀、凝膠掃描儀、圖像分析系統(tǒng) 美國GE公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS） 美國Applied Bio-systems公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取及定量方法

蛋白質(zhì)的提取參照Saravanan等[11]方法并稍作改進。從－80 ℃冰箱稱取5 g荔枝果肉在液氮中充分研磨成粉末，加15 mL酚提取液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，50 mmol/L抗壞血酸，100 mmol/L KCl，50 mmol/L硼砂，10 mL/L Triton-100，20 mL/L β-巰基乙醇，1 mmol/L PMSF），加入等體積的pH 8.0 Tris-飽和酚，充分混勻，5 500×g、4 ℃離心10 min。取酚層，加入6 倍體積的 0.1 mol/L乙酸銨-甲醇溶液，－20 ℃過夜沉淀蛋白。15 000×g、4 ℃離心20 min，棄上清液。沉淀用預冷的甲醇溶液洗滌1 次，再用預冷的丙酮（含0.2 mL/L β-巰基乙醇）洗滌2 次。所得干粉置于－20 ℃保存。取10 mg干燥的樣品粉末溶解于250 μL裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，40 g/L CHAPS，20 mL/L載體兩性電解質(zhì)pH 4～7，40 mmol/L DTT）中，參考Bradford[12]的方法測定蛋白質(zhì)濃度。將裂解好的蛋白液立即進行雙向電泳。

1.3.2 雙向電泳及圖像掃描分析

第一向固相pH值梯度等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）參考Wang等[13]的方法進行。膠條為24 cm、pH 4～7（線性）IPG干膠條。首先將蛋白裂解液與水化液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，20 g/L CHAPS，40 mmol/L DTT，5 mL/L IPG Buffer，0.1 g/L溴酚藍）混合均勻，最終體積定為450 μL。IEF的參數(shù)設(shè)定為：20 ℃，50 μA/trip，30 V（12 h），200 V（1 h），500 V（1 h），1 000 V（1 h），1 000～8 000 V（梯度30 min），8 000 V（48 000 Vhs），1 000 V（3 h）。

IEF結(jié)束后，將膠條用新配制的平衡液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mol/L 尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，10 g/L DTT，痕量溴酚藍）和平衡液Ⅱ（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，6 mol/L 尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，25 g/L IAA，痕量溴酚藍）先后各平衡15 min。平衡結(jié)束后將IPG膠條轉(zhuǎn)移至12%的聚丙烯酰胺凝膠上進行第二向SDS-PAGE垂直板電泳。開始電泳時先設(shè)置15 mA/gel電泳30 min，再加大電流至30 mA/gel。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍R-250染色。

脫色干凈的凝膠用GE公司的凝膠掃描儀進行掃描，分辨率為300 dpi。再用ImageMasterTM軟件（版本7.2.0，Bio-Rad）分析圖像。

1.3.3 蛋白質(zhì)酶解及質(zhì)譜分析

蛋白質(zhì)酶解參考Wang等[13]的方法。差異表達蛋白膠點分別用100 mmol/L NH4HCO3和100 μL乙腈（acetonitrile，ACN）脫色，56～60 ℃真空干燥，加入10 ng/μL Trypsin溶液和等體積的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液，37 ℃反應12 h，加入50% ACN/0.5%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），超聲10 min后抽提酶解產(chǎn)物，真空干燥后用于質(zhì)譜分析。

酶解產(chǎn)物采用4800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。采用氮/氬激光，波長為355 nm，激光強度為4 000 W/cm2，激發(fā)時間為3～7 ns，頻率為200 Hz，加速電壓為20 kV，正離子發(fā)射模式進行采集數(shù)據(jù)。肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）分子質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 D，質(zhì)譜圖用胰蛋白酶酶解肽段進行外標校正。所得結(jié)果用GPS（Applied Biosystems, USA）-MASCOT（Matrix Science, London, UK）軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索。數(shù)據(jù)庫檢索的設(shè)置參數(shù)為：數(shù)據(jù)庫為NCBInr，檢索種屬為綠色植物，檢索的方式為combined，酶為胰蛋白酶，最大允許漏切位點為1，PMF質(zhì)量誤差為100 ppm，MS/MS質(zhì)量誤差為0.2 D。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用ImageMasterTM軟件對凝膠圖像進行差異分析，以2 倍的差異表達為標準。蛋白相對量變化為兩個荔枝品種的3 次生物學重復，所獲得數(shù)據(jù)均以±s表示，并采用SPSS 13.0軟件進行方差分析（P＜0.05為顯著性差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 “烏葉”和“蘭竹”荔枝果肉蛋白的2-DE分析

采用長24 cm、pH 4～7的線性干膠條對“烏葉”和“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期的果肉蛋白質(zhì)進行IEF-SDS-PAGE分離，應用ImageMasterTM軟件對不同荔枝品種轉(zhuǎn)色期果肉的電泳圖譜進行分析，在“烏葉”荔枝圖譜中檢測到1 383 個蛋白點，在“蘭竹”荔枝圖譜中檢測到1 485 個蛋白點，匹配率為76.8%，共發(fā)現(xiàn)了37 個2 倍以上的差異表達蛋白點（圖1）。

圖1 “烏葉”和“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.1 Proteome maps of “Wuye” and “Lanzhu” litchi fruits during color-changing period

2.2 “烏葉”和“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期果肉差異蛋白的質(zhì)譜鑒定

經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜鑒定，37 個差異表達蛋白點中有32 個蛋白點被成功鑒定（表1），鑒定成功率約為86.5%。在被成功鑒定的32 個蛋白中，有13 個蛋白在“烏葉”荔枝品種中上調(diào)表達，19 個蛋白在“蘭竹”荔枝品種中上調(diào)表達（圖2）。此外，在鑒定結(jié)果中，有多個蛋白點被鑒定為同一種蛋白，如spot 5和spot 9均為蛋白酶體β亞基，spot 20和spot 28均為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，表明它們可能是同一個蛋白的不同形式或者是同工酶，具有不同的翻譯后修飾。鑒定出的蛋白點大部分理論分子質(zhì)量與實際分子質(zhì)量相近，但有少數(shù)幾個蛋白點的理論分子質(zhì)量與實際分子質(zhì)量相差較大，如spot 11和spot 13，這可能是由于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后存在著蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及蛋白翻譯后的水解[14-15]。

圖2 “烏葉”和“蘭竹”荔枝果實轉(zhuǎn)色期果實差異蛋白相對表達量變化Fig.2 Relative expression of 37 differentially expressed proteins in“Wuye” and “Lanzhu” litchi fruits

2.3 “烏葉”和“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期果肉差異蛋白

對32 個差異蛋白的功能進行數(shù)據(jù)庫檢索分析后，可以將這32 個差異蛋白分成以下七大類（圖3）：糖類和能量代謝相關(guān)蛋白（7 個，占21.9%）、抗性與脅迫相關(guān)蛋白（3 個，占9.4%）、細胞結(jié)構(gòu)形成相關(guān)蛋白（4 個，占12.5%）、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白（5 個，占15.6%）、次級代謝相關(guān)蛋白（4 個，占12.5%）、發(fā)育調(diào)控相關(guān)蛋白（4 個，占12.5%）、未知功能蛋白（5 個，占15.6%）。

表1 “烏葉”和“蘭竹”荔枝果實轉(zhuǎn)色期果實差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Protein identification of“WWuuyyee” and “Lanzhu”litchi during color-turning period by MALDI-TOF/TOF-MS

圖3 兩個荔枝品種轉(zhuǎn)色期果實差異蛋白功能分類餅圖Fig.3 Classification chart of protein functions in two litchi cultivars during the color-changing period

3 討 論

通過分析32 個差異蛋白發(fā)現(xiàn)，在糖及能量代謝相關(guān)的蛋白中，除三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合酶上的一個亞基外，其余與糖及能量代謝相關(guān)的蛋白在“蘭竹”荔枝品種中的表達量均高于“烏葉”荔枝品種。其中，二磷酸甘油酸依賴磷酸甘油酸變位酶dPGM（spot 34）是糖酵解和糖異生過程中的一個重要酶，催化 3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之間的相互轉(zhuǎn)換[16]，可調(diào)節(jié)糖酵解與其他ATP產(chǎn)生通路以及糖異生之間的平衡。dPGM催化反應需要2,3-二磷酸甘油酸作為輔因子，該類型酶在活性位點上具有保守組氨酸序列，以2,3-二磷酸甘油酸上的磷酸基團為供體使酶活性位點上的組氨酸形成磷酸化的酶-輔因子中間體，通過磷酸化組氨酸中間體催化磷酸基團在磷酸甘油酸和輔因子之間的轉(zhuǎn)移[17-18]。dPGM 除作為糖酵解代謝系統(tǒng)中的一個酶分子，已有研究表明在不同生物內(nèi)該酶的催化機理及行使功能有很大的不同[19-20]，這或許反映出dPGM在細胞中除糖酵解代謝外還發(fā)揮著其他一些功能作用。6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶PGI（spot 36）是調(diào)控糖酵解代謝過程中的第二步酶，在PGI的作用下，6-磷酸-a-D-葡萄糖被異構(gòu)化?！疤m竹”荔枝中dPGM（spot 34）和PGI（spot 36）的表達量均高于“烏葉”荔枝，這說明“蘭竹”荔枝中的與糖酵解有關(guān)的酶含量高，葡萄糖及其他糖類物質(zhì)代謝活躍，降解效率高。這與“蘭竹”荔枝糖含量較低，而“烏葉”荔枝糖含量較高有一定關(guān)聯(lián)。另外，丙酮酸脫羧酶（spot 31）是一種依賴于焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）的非氧化性胞內(nèi)酶。在TPP及Mg2+的輔助下，丙酮酸脫羧酶可以催化α-酮基羧酸脫羧，進而與醛類物質(zhì)發(fā)生縮合反應[21]。同時，它還是乙醇發(fā)酵過程中的關(guān)鍵酶，既能以單一亞基在生物體內(nèi)行使功能，也可以相同亞基的多聚體形式行使生物功能[22]。“蘭竹”荔枝中丙酮酸脫羧酶的表達水平相對于“烏葉”荔枝上升，這暗示“蘭竹”荔枝中以丙酮酸為底物的代謝反應活躍，促進糖酵解代謝中將葡萄糖分解成兩分子丙酮酸，同時釋放出ATP和還原型輔酶Ⅰ（β-nicotinamide-adenine dinucleotide reduced form，NADH）為細胞提供能量這一過程，這也說明“蘭竹”荔枝中的糖類物質(zhì)降解速率高于“烏葉”荔枝，因此“蘭竹”荔枝糖含量較低，而“烏葉”荔枝糖含量較高。這些結(jié)果正好說明了“烏葉”荔枝和“蘭竹”荔枝的在糖分含量上的不同。

膜聯(lián)蛋白是一類鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，分布于各種組織中，在細胞中與膜轉(zhuǎn)運及膜表面依賴于鈣調(diào)蛋白的活動密切相關(guān)[23]。已有大量研究證明，植物中的膜聯(lián)蛋白參與膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、細胞壁的形成以及信號轉(zhuǎn)導等過程[24-25]。此外，膜聯(lián)蛋白還具有過氧化物酶活性，與逆境脅迫響應的調(diào)控過程密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥[26]、耐寒小麥[27]、水稻[28]和芥菜[29]等植物中膜聯(lián)蛋白參與生物和非生物脅迫過程。在“烏葉”荔枝中，膜聯(lián)蛋白（spot 24和25）和微管蛋白β亞基（spot 33）的表達量高于“蘭竹”荔枝的2～3 倍，表明“烏葉”荔枝中參與細胞骨架、細胞壁與細胞膜形成的相關(guān)蛋白酶活性高，代謝旺盛，果肉的質(zhì)地較致密，這與林藝芬等[30]研究發(fā)現(xiàn)的“烏葉”荔枝果肉的質(zhì)地相對較硬，采后果實衰老較慢，耐貯性較好，貨架壽命較長的結(jié)論相一致。植物受到逆境脅迫時，體內(nèi)的過氧化氫會大量積累，此時需要過氧化氫酶等物質(zhì)以消除生物體內(nèi)的過氧化氫、酚類和胺類等毒性物質(zhì)。在“烏葉”荔枝品種中在細胞內(nèi)起過氧化物酶活性作用的膜聯(lián)蛋白（spot 24和25）的表達量顯著高于“蘭竹”荔枝，這說明“烏葉”荔枝的抗性或?qū)δ婢抄h(huán)境的脅迫反應能力可能強于“蘭竹”荔枝。另外，熱休克蛋白70（spot 30）在“烏葉”荔枝中的表達量高于“蘭竹”荔枝2～3 倍，而且熱休克蛋白70可參與逆境脅迫下錯誤折疊蛋白的修復或加速蛋白降解，使細胞保持穩(wěn)態(tài)，防止細胞受損害[31]，這也說明“烏葉”荔枝響應脅迫的能力優(yōu)于“蘭竹”品種，這正好驗證了前人關(guān)于“烏葉”品種的抗性強于“蘭竹”品種的論點[30]。總的來說，這些結(jié)果證實了“烏葉”荔枝果肉致密，耐貯藏，而“蘭竹”荔枝果肉質(zhì)地較軟，貯存性較差。本結(jié)果與“烏葉”和“蘭竹”這兩個品種的實際情況是相一致的。

綜上所述，與“蘭竹”荔枝相比，在轉(zhuǎn)色期，“烏葉”荔枝中與細胞結(jié)構(gòu)形成和抗性調(diào)控相關(guān)蛋白（酶）的上調(diào)表達，糖酵解途徑和能量代謝相關(guān)酶的下調(diào)表達是形成高糖、質(zhì)地密集、耐貯存荔枝品種的重要生理代謝機制。

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Analysis of Differentially Expressed Proteins in Litchi Aril between the Cultivars “Wuye” and “Lanzhu” during the Color-Changing Period

GE Yonghong1,2, ZHONG Canyu1, LIN Weibin1, SHEN Lucen1, QIU Zhimin3, SONG Xiaomin1, HUANG Ronghui1,*
(1. College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Jingtai Testing Station of Quality and Safety of Agricultural Products, Jingtai 730400, China; 3. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The objective of this work was to investigate changes in proteins during the color-changing period of litchi aril (Litchi chinensis Sonn.) on the process of quality formation. The comparison of the protein patterns of the li tchi cultivars“Wuye” and “Lanzhu” using gel-based proteomics technique showed that 37 protein spots were more than 2 times differentially expressed in both cultivars, of which 32 were successfully identifi ed by MALDI-TOF/TOF-MS. The identifi ed proteins were divided into categories related to carbohydrate and energy metabolism (21.9%), stres s resistance (9.4%), protein metabolism (15.6%), cell structure formation (12.5%), secondary metabolism (12.5%), developmental regulation (12.5%), and unknown function (15.6%). Compared to the “Lanzhu” cultivar, the proteins related to glycolytic pathway and energy metabolism were decreased in “Wuye” litchi fruits, implying that slow sugar degradation in the litchi cultivar “Wuye”was benefi cial to the accumulation of sugar and formation of high sugar quality. Besides, the increase of proteins associated with cell structure formation and stress resistance contributed to form the quality of dense texture and good shelf stablility in the litchi cultivar “Wuye” when compared to “Lanzhu”. Our fi ndings provide a scientifi c basis for improving the quality of litchi fruits.

Litchi chinensis Sonn.; aril; differentially expressed proteins; qual ity

10.7506/spkx1002-6630-201601015

S567.1

A

1002-6630（2016）01-0082-06

蓋永紅, 鐘燦鈺, 林偉彬, 等. “烏葉”與“蘭竹”荔枝轉(zhuǎn)色期果肉的差異蛋白分析[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 82-87.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601015. http://www.spkx.net.cn

GE Yonghong, ZHONG Canyu, LIN Weibin, et al. Analysis of differentially expressed proteins in litchi aril between the cultivars“Wuye” and “Lanzhu” during the color-changing period[J]. Food Science, 2016, 37(1): 82-87. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601015. http://www.spkx.net.cn

2015-01-26

福建省自然科學基金項目（2012J01078；2013J01076）

蓋永紅（1984—），女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。E-mail：gaihongnihao@126.com

*通信作者：黃榕輝（1963—），男，副教授，學士，主要從事植物學研究。E-mail：fafuhrh@126.com