肛腸科外用凝膠劑的制備及其體外透皮性能考察

龐曉晨，成睿珍，趙靜

肛洗二號(hào)是一種熏洗湯劑，是天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肛腸科使用多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由黃柏、槐花、苦參、白蘞、五倍子等十余種中藥組成，臨床常用于治療濕熱瘀阻型混合痔術(shù)后的水腫及疼痛，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［1-2］。盡管此方臨床應(yīng)用廣泛，但該劑型存在使用不方便、劑量不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，為了克服上述不足，將傳統(tǒng)劑型改為外用凝膠劑。外用凝膠劑不但具有使用方便、黏性好、刺激性小等特點(diǎn)，而且提高了藥物維持時(shí)間，方便局部給藥［3］。凝膠劑中的藥物經(jīng)皮膚吸收后，可在作用部位直接發(fā)揮藥效，避免了因胃腸道吸收而產(chǎn)生不良反應(yīng)，且凝膠劑易于涂展和洗除，能吸收組織滲出液，不妨礙皮膚正常功能，有利于藥物吸收［4-6］。本研究在肛洗二號(hào)原方的基礎(chǔ)上，從中醫(yī)整體觀念出發(fā)，采用現(xiàn)代中藥制劑的開發(fā)研究方法，對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，并通過改良擴(kuò)散池法，對制劑的透皮性能進(jìn)行考察，為保障和提高凝膠劑質(zhì)量以及該制劑的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 美國Waters超高效液相色譜系統(tǒng)（配有四元高壓梯度泵、在線真空脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV檢測器、Empower 色譜工作站）；十萬分之一分析天平（XP205，Mettler Toledo公司）；萬分之一電子天平（EN 1434，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（Sorvall ST 16R，德國Thermo Fisher公司）；Milli-Q型超純水制備儀（美國Millipore公司）。

1.1.2 試劑與藥物 卡波姆? （Noveu，USA）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司）；甲酸為色譜純蘆丁對照品（批號(hào)100080-201409），購自中國食品藥品生物制品檢定所；中藥飲片（購自天津市中藥飲片廠有限公司和北京盛世龍藥業(yè)有限公司，均符合相關(guān)規(guī)定［7］）。

2 制備方法

本研究時(shí)間為2016年9—11月。

2.1 肛腸外用凝膠劑的制備 分別選取濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的卡波姆為基質(zhì)制備成水溶性凝膠劑。以外觀性狀、離心實(shí)驗(yàn)、耐熱耐寒實(shí)驗(yàn)為指標(biāo)，篩選最佳濃度的基質(zhì)。

2.1.1 外觀性狀及評分標(biāo)準(zhǔn) 外觀：黃色或黃褐色半固體、質(zhì)地均勻、無分層現(xiàn)象；涂展性：易于涂展于皮膚或黏膜上；細(xì)膩度：均勻，涂布于手上無粗粒存在，在玻璃板上涂布薄薄一層時(shí)無肉眼可見的單獨(dú)顆粒或氣泡。評分標(biāo)準(zhǔn)：無分層現(xiàn)象、稠度適中、細(xì)膩光滑易涂展、保濕效果好為10分，部分分層、稠度較合適、稍有顆粒感易涂展、保濕效果一般為5分，完全分層、稠度過稠、有顆粒感不易涂展、保濕效果不好為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質(zhì)外觀形狀評分見表1。

2.1.2 離心實(shí)驗(yàn)及評分標(biāo)準(zhǔn) 將制備好的凝膠劑置于10 ml離心管中，3 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm），觀察有無分層現(xiàn)象。評分標(biāo)準(zhǔn)：無分層現(xiàn)象為20分，部分分層為10分，完全分層為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質(zhì)離心試驗(yàn)評分見表1。

2.1.3 耐熱耐寒實(shí)驗(yàn)及評分標(biāo)準(zhǔn) 將制備好的凝膠劑分別置于-15 ℃冷凍箱24 h、55 ℃恒溫干燥箱6 h后取出，將置于冷凍箱的基質(zhì)水浴加熱復(fù)融，分別觀察有無分層現(xiàn)象。評分標(biāo)準(zhǔn)：無分層為10分，部分分層為5分，完全分層為0分。以不同濃度的卡波姆制成的凝膠基質(zhì)耐熱耐寒實(shí)驗(yàn)評分見表1。

2.1.4 最佳濃度基質(zhì)篩選 卡波姆濃度為0.5%和1.0%時(shí)凝膠基質(zhì)為液體，能夠流動(dòng)，不適合作為凝膠基質(zhì)；而卡波姆濃度為2.0%時(shí)凝膠基質(zhì)則略顯黏稠，卡波姆濃度為1.5%時(shí)制劑評分最高。

表1 不同濃度卡波姆為基質(zhì)時(shí)凝膠劑的評分（分）Table 1 Scores of the formulation with different concentrations of carbomer

考慮到處方所用部位及涂布的困難程度，本研究最終選用1.5%作為處方的基質(zhì)濃度。

2.2 體外透皮色譜條件 色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A 0.1%甲酸水溶液，B乙腈溶液；梯度洗脫：0～6 min，15% B；6～7 min，15%B～25% B；7～8 min，25% B；流速0.3 ml/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μl。

2.3 對照品、供試品溶液的制備 對照品溶液：精密稱取適量蘆丁，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml含有4 100 ng蘆丁的對照品溶液。供試品溶液：稱取一定量凝膠劑于50 ml量瓶中，加入甲醇超聲溶解，溶解后甲醇定容，取出部分溶液于離心機(jī)內(nèi)10 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，經(jīng)0.20 μm有機(jī)濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取對照品溶液、不加蘆丁的空白溶出物以及凝膠劑的透皮溶出物，采用超高效液相色譜（UPLC）法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示UPLC法對于本研究的專屬性較好（見圖1）。

圖1 超高效液相色譜圖Figure1 UPLC chromatogram

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取對照品溶液，配成含205、410、820、1 640、2 050、4 100 ng/ml蘆丁的樣品溶液。按照2.2中的色譜條件行UPLC分析，記錄色譜峰面積（A）。以A為因變量（Y），以濃度（C）（ng/ml）為自變量（X）進(jìn)行線性回歸分析，繪制A與C的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=14.282X+862.32（r=0.999 9），線性范圍為205～4 100 ng/ml。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取含410、1 640、2 050 ng/ml蘆丁的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，測定A，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度（RSD）。結(jié)果顯示3種濃度的對照品溶液日內(nèi)RSD分別為1.07%、1.19%、1.82%，日間RSD分別為0.33%、1.96%、0.45%，表明儀器RSD良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取凝膠劑適量，共6份，按2.3中的方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測定。蘆丁的平均濃度為（488.9±7.8）ng/ml，RSD為1.58%，表明供試品溶液的方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測定含量的樣品溶液適量，共6份，分別精密加入一定量的對照品溶液，按2.3中的方法制備供試品溶液進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示，蘆丁的平均回收率（n=6）為100.35%，RSD＜2.00%（見表2）。

表2 透皮吸收加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the recovery rats of transdermal absorption

2.5 體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.5.1 離體鼠皮的制備 剃去大白鼠腹部絨毛，脫頸處死，剝離皮膚。小心剔除皮下的脂肪組織及粘連物至皮膚成半透明狀；用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗干凈，將破損處剪除，加入適量0.9%氯化鈉溶液浸沒鼠皮，密封放于冰箱（-20 ℃）中保存。

2.5.2 分組 分為制劑組和溶液組，制劑組使用自制的外用凝膠劑，溶液組使用肛洗二號(hào)提取后得到的復(fù)方湯劑。

2.5.3 體外透皮實(shí)驗(yàn)方法 采用改良Franz擴(kuò)散池法，將離體鼠皮固定在改良Franz擴(kuò)散池的供給池和接受池之間，角質(zhì)層面向供給池，以新鮮配制的接受遞質(zhì)，預(yù)熱（32±1）℃，在供給池中加入制劑，于循環(huán)水浴（32±1） ℃中連續(xù)磁力攪拌（約300 r/min）。在實(shí)驗(yàn)開始后分別于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h從接受池中取出2 ml接收遞質(zhì)，同時(shí)向接受池中補(bǔ)加等量的供給液。樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，UPLC法測定C，并以此計(jì)算累積滲透量（Q）、表觀滲透系數(shù)（Papp）及穩(wěn)態(tài)流量（Jss）。

2.5.4 數(shù)據(jù)處理 采用UPLC法測定樣品含量，計(jì)算單位面積內(nèi)藥物Q（μg/cm2），以Q對t/h做圖，得藥物累積滲透曲線。對所得曲線的直線部分進(jìn)行回歸分析，斜率即為藥物的Jss（μg·cm-2·h-1）。

其中Cn為t時(shí)間藥物的測定濃度，Ci為t時(shí)間前的測定濃度，V0為接受池中溶液體積，V為取樣體積。

其中C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；ΔQ/Δt可由累積透過量-時(shí)間曲線穩(wěn)態(tài)部分的斜率求得。Jss= C0·Papp

2.5.5 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將樣品各時(shí)間點(diǎn)滲透量的均數(shù)與時(shí)間的關(guān)系，分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuchi方程、Ritger-Peppas方程4種數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，分析其體外滲透性。溶液組和制劑組的透皮擴(kuò)散均符合Higuchi方程，說明二者均有緩釋的作用。溶液組的滲透動(dòng)力學(xué)方程為Q=0.964 8t1/2+7.678，r2= 0.926 8，制劑組的滲透動(dòng)力學(xué)方程為Q=2.171 1t1/2+6.993 7，r2= 0.995 6（見表 3）。

表3 體外透皮實(shí)驗(yàn)參數(shù)Table 3 Experimental parameters of in vitro transdermal experiments

從藥物累積滲透曲線（見圖2）可以看出，蘆丁在皮膚中的滲透可維持24 h 以上的穩(wěn)態(tài)釋放速率。溶液組24 h內(nèi)的Q 為（11.57±0.28）ng·cm-2·h-1，制劑組24 h 內(nèi)的Q為（17.86±1.26）ng·cm-2·h-1，制劑組的Q是溶液組的1.54倍。溶液組的Papp和Jss分別為（12.43 ±1.26）cm/s 和（5.00 ±0.51）ng·cm-2·h-1，而制劑組的Papp和Jss分別為（26.29 ±3.49）cm/s和（12.70±1.68）ng·cm-2·h-1。兩組Papp和Jss比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tPapp=0.001，p＜0.01；tJss=0.001，p＜0.01）。

3 討論

3.1 外用凝膠劑的制備 水溶性凝膠劑是常用的透皮給藥劑型，是指藥物與形成凝膠的輔料溶解或分散在高分子材料中，形成的均一、混懸的黏稠液體或半固體制劑。本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)劑型制備為外用凝膠劑，不但使其局部給藥更加方便、減少了刺激性，而且避免了因胃腸道吸收而產(chǎn)生不良反應(yīng)，延長了藥物維持時(shí)間。

圖2 藥物累積滲透曲線（，n=5）Figure 2 Drug cumulative permeability curves

3.2 體外分析方法 本研究建立的體外分析方法不但分析速度快而且專屬性較強(qiáng)、靈敏度高。在既往文獻(xiàn)報(bào)道［8-9］的基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果顯示，蘆丁在260 nm有較好的吸收，因此，選取260 nm作為蘆丁的最大吸收波長，以UPLC法作為分析方法，采用梯度洗脫，建立了體外透皮研究的含量測定方法。3.3 體外透皮實(shí)驗(yàn) 本研究結(jié)果顯示，制劑組的Q是溶液組的1.54倍，且兩組的Papp和Jss間有明顯差異。說明與水溶液相比，凝膠制劑具有良好的經(jīng)皮滲透性，能夠顯著增加單位面積的Q和Jss，有較好的透皮滲透性。

總之，本研究將傳統(tǒng)劑型制備為外用凝膠劑，不但使其局部給藥更加方便、減少了刺激性，而且避免了因胃腸道吸收而產(chǎn)生不良反應(yīng)，延長了藥物維持時(shí)間。且與水溶液相比，凝膠制劑具有良好的經(jīng)皮滲透性，能夠顯著增加單位面積的Q、穩(wěn)態(tài)透皮速率，說明凝膠劑能顯著提高透皮滲透性。在今后的研究中，可以根據(jù)處方的特點(diǎn)，對促滲劑進(jìn)行篩選，加入適合的促滲劑，以更好地提高凝膠劑的透皮效果。

作者貢獻(xiàn)：龐曉晨進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)和資料的收集、整理，撰寫論文；成睿珍進(jìn)行論文的修訂；趙靜進(jìn)行論文的審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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