白果中植物甾醇的提取工藝優(yōu)化及體外釋放研究

劉真陽 張碧霄 李非凡 梅曉宏

摘?要：目的：優(yōu)化白果中植物甾醇的提取并考察其體外釋放情況。方法：以白果為原料，以乙醇為提取溶劑，使用超聲波輔助提取法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了白果中植物甾醇的提取工藝，進(jìn)一步通過體外模擬消化試驗(yàn)，分析了添加油脂、熱處理方式、物料粉碎程度對(duì)甾醇體外釋放的影響。結(jié)果：超聲時(shí)間、料液比、超聲功率均影響甾醇的提取率。超聲功率對(duì)提取率具有顯著影響，最佳工藝為超聲時(shí)間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時(shí)可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。體外模擬消化試驗(yàn)證明，添加油脂、熱處理方式、物料粉碎程度均對(duì)植物甾醇的體外釋放具有顯著影響，當(dāng)使用微波加熱處理時(shí)，甾醇的釋放情況最佳。

關(guān)鍵詞：白果;植物甾醇;模擬消化

銀杏的種子——白果，其營養(yǎng)豐富，具有益肺氣、治喘咳、止滯濁、擴(kuò)張微血管、增加血流量等藥用功效，食用價(jià)值很高[1?2]。植物甾醇是植物中的活性成分，其廣泛存在于各種植物油、堅(jiān)果和植物種子中，在結(jié)構(gòu)上與膽甾醇相似[3]。作為一類獨(dú)特的多功能活性因子，植物甾醇具有許多重要的生理功能，在心血管疾病的預(yù)防與緩解、抗腫瘤以及消炎退熱等方面應(yīng)用前景廣闊[4?6]?；谥参镧薮紝?duì)人體的諸多功能及其特有的性質(zhì)，植物甾醇已在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用[7?8]。然而，人體不能合成植物甾醇，只能從食物中攝取。且膳食中植物甾醇的吸收率較低，約為0.02%～3.5%[9]，這與植物甾醇的水溶性差有關(guān)，已有研究證明，烹調(diào)過程中添加適量油脂有利于提高脂溶性成分的生物利用率[10]。不僅如此，烹調(diào)方式與物料性質(zhì)對(duì)營養(yǎng)成分的釋放具有較大影響[11?12]。目前，對(duì)于白果中植物甾醇的研究較少。本研究對(duì)白果中的植物甾醇進(jìn)行提取工藝優(yōu)化、含量測(cè)定，并分析體外釋放情況，模擬蒸、煮、微波3種烹飪方式對(duì)甾醇釋放的影響，以期提高白果的利用率。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

白果、大豆油，購于當(dāng)?shù)爻?β?谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、胃蛋白酶、豬膽鹽、脂肪酶，美國Sigma公司;無水乙醇、六水合三氯化鐵、無水氯化鈣、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氫氧化鉀、磷酸，分析純，購自西亞試劑。

1.2?儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司;Varioskan Flash全波長酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司;JY98?IIIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;101?0ES型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;TGL?16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司;LGJ?25C型冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?單因素試驗(yàn)?預(yù)先將白果去殼、冷凍干燥并粉碎處理，記錄凍干前、后白果的重量，分別記為Wf、Wd，并計(jì)算白果的含水率[13]，公式為式（1）：

含水率（%）=Wf-WdWf×100（1）

以凍干后的白果粉為原料，選擇無水乙醇為提取溶劑，使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行白果中植物甾醇的提取。準(zhǔn)確稱取2.0 g白果粉，加入一定量的無水乙醇，使用超聲波細(xì)胞破碎儀破壁處理，將提取液置于70℃烘箱中，徹底烘干，之后重新加入20 mL無水乙醇，混合均勻后，取溶有植物甾醇的乙醇溶液用于后續(xù)植物甾醇的定量分析，計(jì)算干物質(zhì)（白果粉）中植物甾醇的含量[mg/（g·dw）]，下同。固定料液比1∶10 mL/g、超聲時(shí)間6 min，選取超聲功率分別為200、250、300、350、400W進(jìn)行試驗(yàn)，考察超聲功率對(duì)植物甾醇提取率的影響。在料液比為1∶10 mL/g、超聲功率為350 W的條件下，選取超聲時(shí)間分別為2、4、6、8、10 min進(jìn)行試驗(yàn)，考察超聲時(shí)間對(duì)植物甾醇提取率的影響。在超聲功率為350 W、超聲時(shí)間為6 min的條件下，選取料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 mL/g進(jìn)行試驗(yàn)，考察料液比對(duì)植物甾醇提取率的影響。

1.3.2?植物甾醇提取的正交試驗(yàn)?單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲時(shí)間（A）、料液比（B）、超聲功率（C）均可影響白果中植物甾醇的提取。為獲得最佳甾醇提取率，采用正交試驗(yàn)L9（34）對(duì)上述因素進(jìn)行優(yōu)化（表1）。

1.3.3?植物甾醇含量的測(cè)定?采取硫磷鐵法測(cè)定樣品中植物甾醇的含量[14]。精確稱取1.25 g六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O），使用85%的磷酸定容至50 mL，制得鐵貯存液，室溫下可長期貯存于棕色瓶中。量取8 mL鐵貯存液，使用濃硫酸定容至100 mL，制得硫磷鐵顯色劑。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：使用少量無水乙醇將10 mg β?谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶解，并轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容。使用前稀釋10倍，即母液質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的0.1 mg/mL β?谷甾醇溶液于試管中，繼續(xù)添加無水乙醇至4.0 mL，加入2.0 mL硫磷鐵顯色劑，振蕩搖勻，15 min后在波長750～450 nm內(nèi)掃描，確定最大吸收波長。并以β?谷甾醇溶液質(zhì)量濃度（單位為mg/mL）為橫坐標(biāo)、以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品在最大吸收波長處的吸光值以及擬合線性良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中植物甾醇的含量。

1.3.4?體外模擬胃腸道消化試驗(yàn)?參考Huang等[15]的方法并稍作修改。將新鮮白果去殼，稱取5 g去殼白果，并對(duì)其進(jìn)行3種烹調(diào)處理，分別為：（1）煮：沸水中煮約15 min;（2）蒸：隔水加熱約30 min;（3）微波：微波加熱約5 min。之后，將熟白果分別進(jìn)行粉碎與切塊（0.3 cm3左右）處理，模擬消化前加入不同質(zhì)量的大豆油（不添加、0.5 g、1.0 g、1.5 g）。在此基礎(chǔ)上，研究烹調(diào)方式、粉碎程度、油的添加量對(duì)熟白果中植物甾醇釋放率的影響。模擬消化過程為：按照1∶10（w/v）的比例將白果與50 mL模擬胃液[0.32%胃蛋白酶（3 000 U/mL），0.2%NaCl，w/v]混合，使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，在37℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中模擬胃消化1 h。之后，按照1∶10（w/v）的比例向胃消化?1 h后的樣品中加入50 mL模擬腸液（0.68%K2HPO4、5 mmol/L CaCl2、10 mg/mL豬膽鹽、0.4 mg/mL脂肪酶，w/v），使用1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，在37℃、60 r/min的恒溫?fù)u床中繼續(xù)模擬腸消化2 h。

消化結(jié)束后，將消化液在8 000 r/min下離心10 min，離心后，上層為含有甾醇的油相，中層為水相，下層為消化后的固體殘?jiān)Ｈ∩蠈佑拖噙M(jìn)行皂化處理，具體方法為：稱取50 mg油脂樣品，加入2 mL皂化液（2 mol/L氫氧化鉀?乙醇溶液），加蓋密封，混勻，渦旋振蕩?1 min;置于70℃恒溫水浴鍋中振搖皂化45 min。室溫冷卻后加入二氯甲烷5 mL、超純水3 mL，混合均勻，?6 000 r/min離心5 min，使用分液漏斗收集下層有機(jī)相，使用5 mL超純水清洗3次，棄上清，烘干有機(jī)相。使用無水乙醇重新定容至10 mL，用于后續(xù)植物甾醇的定量分析。以加入等量大豆油為對(duì)照組，計(jì)算模擬消化后植物甾醇的釋放量，公式為式（2）：

釋放量[mg/（g·dw）]=處理組甾醇含量-對(duì)照組甾醇含量1-含水量（2）

1.4?數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差試驗(yàn)設(shè)計(jì)與單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著;使用Origin 8.0軟件進(jìn)行圖形繪制。

2?結(jié)果與分析

2.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

β?谷甾醇溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）與吸光度值（A）的線性關(guān)系如圖1所示，標(biāo)曲方程為Y（A）=5.007X-0.012，決定系數(shù)R2=0.987 7，說明擬合情況良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)中植物甾醇的定量分析。

2.2?單因素試驗(yàn)

2.2.1?超聲時(shí)間對(duì)植物甾醇提取率的影響?由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間為2～10 min時(shí)，植物甾醇提取率呈現(xiàn)出先增大再減小的變化趨勢(shì)，在8 min時(shí)達(dá)最大值，且顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇6、8、10 min三個(gè)水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2?料液比對(duì)植物甾醇提取率的影響?由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶15 mL/g時(shí)提取率最大，顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇1∶10、1∶15、1∶20 g/mL三個(gè)水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3?超聲功率對(duì)植物甾醇提取率的影響?由圖4可知，當(dāng)超聲功率為200～400 W時(shí)，植物甾醇提取率呈現(xiàn)出先增大再減小的變化趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為350W時(shí)達(dá)最大值，且顯著高于其他組（P<0.05），因此選擇300、350、400 W三個(gè)水平用于后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3?正交試驗(yàn)及方差分析

按照正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取優(yōu)化，如表2所示，根據(jù)正交試驗(yàn)的直觀分析法可得到因素的主次順序依次為超聲功率（因素C）、料液比（因素B）、超聲時(shí)間（因素A）。主要因素（超聲功率）取最佳水平，次要因素（超聲時(shí)間、料液比）根據(jù)成本等取適當(dāng)水平，由此得到各因素的最佳搭配為A1B2C2，即最佳工藝為超聲時(shí)間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時(shí)可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。如表3所示，只有超聲功率（因素C）的P值=0.014<0.05，即超聲功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，而超聲時(shí)間（因素A）與料液比（因素C）的P值均大于0.05，說明二者對(duì)甾醇提取率具一定影響，但并不顯著。即超聲功率為主要因素，超聲時(shí)間與料液比為次要因素，這一結(jié)果與直觀分析法的結(jié)論相符。

2.4?體外模擬消化處理中植物甾醇的釋放情況

如表4所示，其中未加入大豆油時(shí)，離心后僅有水層與下層殘?jiān)?，無明顯上層油相，因此無法檢測(cè)到甾醇的釋放情況，這是因?yàn)榘坠闹竞枯^少，僅占鮮重的2%左右，這也說明，僅有加熱處理與消化液不足以促進(jìn)甾醇的釋放。樣品粉碎后，使用微波處理時(shí)，隨著油的增多，甾醇釋放率呈現(xiàn)出顯著上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)（P<0.05）;使用蒸、煮處理時(shí)，加入1.5 g大豆油時(shí)甾醇的釋放率顯著升高（P<0.05），這說明添加油脂可以有效改善甾醇的釋放情況，這是因?yàn)橹参镧薮际且环N極性較弱且微量的物質(zhì)，同樣弱極性的油脂可以較好地溶解植物甾醇，這與已有研究結(jié)果相似[16]。當(dāng)添加等量大豆油時(shí)，微波處理后甾醇的釋放率均顯著高于蒸、煮處理（P<0.05），這說明，與蒸、煮相比，微波處理可以更有效地促進(jìn)白果中植物甾醇的釋放，這可能是由于微波處理能夠有效地破壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放到油脂中[17]。對(duì)于塊狀樣品，不同處理方式下其甾醇釋放率均較低，且處理方式對(duì)其甾醇釋放率無顯著影響（P<0.05），這說明物料的粉碎程度對(duì)甾醇的釋放影響較大，這可能是因?yàn)榉鬯樘幚碓龃罅宋锪吓c消化液的接觸面積。樊金嶺等[18]研究表明，不同機(jī)械加工方式對(duì)胡蘿卜中β?胡蘿卜素生物接近度的影響較大，打漿處理可有效提高β?胡蘿卜素的釋放率與膠束化率。上述結(jié)果說明，添加油脂更有利于甾醇的釋放，而微波處理可代替?zhèn)鹘y(tǒng)蒸、煮，進(jìn)一步促進(jìn)白果中甾醇的釋放。

3?結(jié)論

本研究使用超聲波輔助提取法進(jìn)行白果中植物甾醇的提取，通過單因素試驗(yàn)，驗(yàn)證了超聲時(shí)間、料液比、超聲功率均會(huì)影響甾醇的提取率。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲功率對(duì)甾醇提取率具有顯著影響（P<0.05），因素的主次順序依次為超聲功率、料液比、超聲時(shí)間，最佳工藝為超聲時(shí)間6 min、料液比1∶15 g/mL、超聲功率350W，此時(shí)可得最大甾醇提取率為0.878 mg/（g·dw）。通過體外模擬消化試驗(yàn)分析白果中植物甾醇的體外釋放情況，發(fā)現(xiàn)粉碎樣品與添加油脂均有利于甾醇的釋放，與傳統(tǒng)蒸、煮相比，微波處理可進(jìn)一步促進(jìn)甾醇的釋放。◇

參考文獻(xiàn)

[1]閻小紅，趙潔.銀杏的營養(yǎng)價(jià)值及其加工利用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2013（12）：44?45.

[2]梁子紅，謝鵬，朱潤秀，等.銀杏葉提取物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2018，21（5）：570?575.

[3]Moreau R A，Whitaker B D，Hicks K B.Phytosterols，phytostanols，and their conjugates in foods：structural diversity，quantitative analysis，and health?promoting uses[J].Progress in Lipid Research，2002，41（6）：457?500.

[4]Simin Feng，Zhuqing Dai，Anna B，et al.Intake of stigmasterol and β?sitosterol alters lipid metabolism and alleviates NAFLD in mice fed a high?fat western?style diet[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）?Molecular & Cell Biology of Lipid，2018，1863（10）：1274?1284.

[5]Shin E J，Choi H K，Sung M J，et al.Anti?tumour effects of beta?sitosterol are mediated by AMPK/PTEN/HSP90 axis in AGS human gastric adenocarcinoma cells and xenograft mouse models[J].Biochemical Pharmacology，2018，152：60?70.

[6]Robert A Moreau，Laura Nystrim，Bruce D Whitaker，et al.?Phytosterols and their derivatives：structural diversity，distribution，metabolism，analysis，and health?promoting uses[J].Progress in Lipid Research，2018，70：35?61.

[7]Plumb J A，Mjc R，Lampi A M，et al.Phytosterols in plant foods：exploring contents，data distribution and aggregated values using an online bioactives database[J].Journal of Food Composition & Analysis，2011，24（7）：1024?1031.

[8]Simin Feng，Zhuqing Dai，Anna B，et al.Intake of stigmasterol and β?sitosterol alters lipid metabolism and alleviates NAFLD in mice fed a high?fat western?;style diet[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）?Molecular & Cell Biology of Lipid，2018，1863（10）：1274?1284.

[9]韓軍花，楊月欣，馮妹元，等.中國常見植物食物中植物甾醇的含量和居民攝入量初估[J].衛(wèi)生研究，2007，36（3）：301?305.

[10]代蕾，孫翠霞，劉夫國，等.油脂添加及加工模式對(duì)果蔬中類胡蘿卜素生物接近度影響[J].中國食品添加劑，2016，143（1）：27?32.

[11]常麗新，韓近，王換霞.不同烹調(diào)方法對(duì)野生蔬菜營養(yǎng)成分的影響[J].食品工業(yè)科技，2005，26（4）：163?168.

[12]Cilla A，Bosch L，Barberá，Reyes，et al.Effect of processing on the bioaccessibility of bioactive compounds?A review focusing on carotenoids，minerals，ascorbic acid，tocopherols and polyphenols[J].Journal of Food Composition and Analysis，2017，68：3?15.

[13]馮景，沈永寶，史鋒厚.銀杏種子脫水敏感性的研究[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，43（6）：193?200.

[14]劉蕾，陳星，李曉麗，等.分光光度法測(cè)定大豆總甾醇含量的研究[J].中國油脂，2005（4）：45?47.

[15]Huang Haizhi，Sun Yujing，Lou Shuting，et al.In vitro digestion combined with cellular assay to determine the antioxidant activity in Chinese bayberry（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）fruits：a comparison with traditional methods[J].Food Chemistry，2013，146：363?370.

[16]白喜婷，樊金玲，朱文學(xué)，等.機(jī)械加工及油脂對(duì)南瓜類胡蘿卜素生物接近度的影響[J].食品與機(jī)械，2014，30（5）：3?9.

[17]Colle I J P，Lemmens L，Van Buggenhout S，et al.?Processing tomato pulp in the presence of lipids：The impact on?lycopene bioaccessibility[J].Food Research International，2013，51（1）：32?38.

[18]樊金玲，宋會(huì)娟，孫玉宇，等.機(jī)械加工方式及油脂對(duì)胡蘿卜中β?胡蘿卜素生物接近度的影響[J].食品科學(xué)，2014，35（15）：25?29.

Extraction Optimization and in Vitro Release of Phytosterol from Ginkgo

LIU Zhen?yang，ZHANG Bi?xiao，LI Fei?fan，MEI Xiao?hong

（College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract：?Objective To optimize the extraction of phytosterol from ginkgo and further evaluate in vitro release of phytosterol. Method Ultrasonic?assisted extraction was used and orthogonal test was applied for optimization.Simulated digestion experiment was carried out to analyze the effect of additional oil，heat treatment and grinding on in vitro release of phytosterol. Result Based on the single factor experiment，extraction time，solid?liquid ratio，and ultrasonic power could affect extraction efficiency，while only ultrasonic power showed significant influence according to orthogonal test.Besides，the optimization was extraction time 6 min，the ratio of material to solvent 1∶15 g/mL，and ultrasonic power 350 W.Under these conditions，the theoretic yield was 0.878 mg/（g·dw）.Simulated digestion experiment evidenced that additional oil，heat treatment and thorough grinding facilitated phytosterol release，and microwave heat?treatment showed the best release ratio.

Keywords：ginkgo;phytosterol;simulated digestion