宏蛋白質(zhì)組學(xué)在酒曲酶學(xué)及蛋白組成功能研究中的應(yīng)用

左乾程

摘 要：宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能夠?qū)μ囟悠分形⑸锞捍x產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研究，還能直觀地揭示研究對象中微生物與代謝蛋白的功能及其相互關(guān)系，是未來解析酒曲中酶和蛋白質(zhì)的組成及其功能、探究酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理及提升其風(fēng)味品質(zhì)的重要手段和研究方向。本文綜述了宏蛋白組學(xué)的研究方法及策略，介紹了其在醬香高溫大曲、清香中溫大曲及黃酒麥曲酶學(xué)及蛋白組成功能研究中的應(yīng)用，并對其在酒曲研究中的應(yīng)用作了展望。

關(guān)鍵詞：宏蛋白質(zhì)組學(xué);酒曲;酶學(xué);蛋白質(zhì)組成及功能

中國酒曲歷史悠久，其獨特的制作技術(shù)可追溯到四五千年前，是世界上最早保存釀酒微生物及其代謝產(chǎn)物的技術(shù)。酒曲的發(fā)明，是我國古代人民對世界的重要貢獻(xiàn)，被稱作中國“第五大發(fā)明”。中國酒曲種類豐富，包括釀造白酒的大曲、小曲和麩曲以及釀造黃酒的麥曲等。酒曲既是糖化發(fā)酵劑，又是釀酒原料，同時也能為酒體提供風(fēng)味物質(zhì)和生香前體物質(zhì)[1]，對酒中的香氣和風(fēng)味物質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)，可以說，在一定程度上，酒曲的質(zhì)量決定了酒的質(zhì)量。中國酒曲多采用生料制曲，經(jīng)自然接種，多菌種混合發(fā)酵而成，這樣做有利于保存原料中的豐富酶系，同時，在制曲過程中，豐富的微生物種群產(chǎn)生了大量的酶類及其他風(fēng)味物質(zhì)前體物，這些酶蛋白和風(fēng)味物質(zhì)前提物，是實現(xiàn)酒曲功能及構(gòu)成酒體香氣風(fēng)味的生物化學(xué)基礎(chǔ)[2]。了解曲中酶和蛋白的組成及功能，對探究酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理及提升酒體風(fēng)味品質(zhì)具有重要作用，要研究酒曲的功能，解釋其發(fā)酵過程的釀造機(jī)理，就要從總體上對酒曲的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，即進(jìn)行宏蛋白組學(xué)研究。

1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)及研究方法

1994年，Wilkins和Williams首次提出了蛋白質(zhì)組學(xué)的概念，它是指細(xì)胞、組織或機(jī)體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用范圍較廣，例如詮釋基因組、研究蛋白質(zhì)的表達(dá)及功能，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等[3]。然而蛋白組學(xué)的研究對象一般為純培養(yǎng)微生物的代謝物、單一細(xì)胞或組織[3]。對組成復(fù)雜、含有大量未能培養(yǎng)微生物的樣品，如酒曲等，蛋白組學(xué)的研究就不是很適用。因此，采用宏蛋白質(zhì)組學(xué)對組成復(fù)雜的物質(zhì)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行研究就顯得非常重要。

宏蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)流程主要包括：樣品（蛋白質(zhì)）的制備，蛋白分離以及蛋白鑒定。

1.1 樣品制備

在酒曲宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，樣品的制備即為酒曲中總蛋白質(zhì)的提取，這是酒曲宏蛋白組學(xué)技術(shù)研究的關(guān)鍵及前提，蛋白樣品制備的優(yōu)劣往往決定著后續(xù)研究的成敗。由于酒曲中微生物菌群組成復(fù)雜、差異較大，且酒曲中存在有一定數(shù)量的低豐度功能蛋白需要純化，目前還沒有一種提取酒曲宏蛋白的通用方法，因此，在具體的研究過程中，需要根據(jù)研究對象的性質(zhì)及特點，選擇合適的方法對酒曲中的總蛋白進(jìn)行提取。

1.2 蛋白分離

宏蛋白組學(xué)研究中常用的蛋白分離方法有兩種：雙向凝膠電泳及色譜技術(shù)。雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)是一種應(yīng)用較為廣泛的經(jīng)典方法[4]，該方法具備能夠?qū)?fù)雜蛋白質(zhì)混合對象實現(xiàn)鑒定及定量分析的特點，美中不足的是這種技術(shù)在分離一些低豐度、疏水性蛋白時，效果不佳。近年來，色譜分離技術(shù)及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不斷發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用逐漸廣泛起來，色譜技術(shù)的分辨率和直觀性雖然不能與雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)相媲美，但其分離效果卻是雙向凝膠電泳-質(zhì)譜技術(shù)望塵莫及的，能夠獲得更加精確的蛋白質(zhì)信息，色譜技術(shù)將會在宏蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中得到較為廣泛的應(yīng)用[5]。

1.3 蛋白鑒定

目前，鑒定研究對象中的蛋白質(zhì)常采用質(zhì)譜法，常用的有串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）法、基質(zhì)輔助激光解析時間-飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）以及四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF-MS）。除此之外，蛋白數(shù)據(jù)庫的選擇也很關(guān)鍵，要通過了解樣品的特性來進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的選擇，樣品中蛋白質(zhì)與數(shù)據(jù)庫中蛋白的相似性越高，代表蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性也就越高。對于樣品中未培養(yǎng)的微生物，由于沒有對應(yīng)的蛋白信息，使得蛋白的鑒定存在很大的困難，因此，迫切需要完善宏蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫來進(jìn)行蛋白鑒定。

2 基于宏蛋白組學(xué)技術(shù)的中國酒曲研究進(jìn)展

近年來，隨著宏蛋白組技術(shù)的不斷發(fā)展，其越來越多的被應(yīng)用到了酒曲酶學(xué)及蛋白組成功能的研究中，包括了醬香高溫大曲、清香中溫大曲以及黃酒麥曲的宏蛋白組學(xué)研究。了解酒曲中酶和蛋白的組成及功能，對探究酒中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理及提升其風(fēng)味品質(zhì)具有重要作用。

2.1 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在醬香高溫大曲研究中的應(yīng)用

宏蛋白質(zhì)組學(xué)在高溫大曲研究中的應(yīng)用主要包括分析比較不同大曲宏蛋白組組成成分的差異、不同發(fā)酵條件下大曲微生物分泌胞外蛋白酶的差異，黃永光等[6]對高溫大曲中Aspergillus hennebergii菌株在固、液兩種狀態(tài)下生長時的胞外蛋白組進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明固態(tài)發(fā)酵條件下，Aspergillus hennebergii菌株代謝產(chǎn)生的糖化酶及蛋白酶酶活高于液態(tài)發(fā)酵條件下的酶活。表明Aspergillus hennebergii菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下能夠分泌更多的蛋白酶和糖化酶，從而使白酒的發(fā)酵更為順利，能夠產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。

2.2 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在清香中溫大曲研究中的應(yīng)用

目前，宏蛋白質(zhì)組學(xué)主要應(yīng)用于確定清香中溫大曲中酶的微生物來源，為確定清香白酒發(fā)酵的功能微生物提供可靠信息。張秀紅等[7]對清香白酒釀造使用的3種中高溫大曲進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)大曲中檢測到的糖化酶均來自于米根霉，由此認(rèn)為米根霉為清香白酒大曲中產(chǎn)糖化酶的功能菌。

2.3 宏蛋白質(zhì)組學(xué)在黃酒麥曲研究中的應(yīng)用

宏蛋白質(zhì)組學(xué)在黃酒麥研究中的應(yīng)用主要是研究制曲過程中宏蛋白質(zhì)組的變化情況，進(jìn)而理解麥曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)機(jī)理，以對酒曲質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。管政兵等[8]對紹興黃酒麥曲制曲過程中的6個不同時期（起始期、發(fā)酵前期、升溫期、高溫期、降溫期與成熟期）進(jìn)行了蛋白組學(xué)研究，雙向電泳實驗結(jié)果表明，麥曲發(fā)酵過程中12個蛋白點發(fā)生了明顯的動態(tài)變化。

3 結(jié)論與展望

雖然目前宏蛋白組學(xué)技術(shù)在中國酒曲研究中的應(yīng)用不多，但蛋白質(zhì)才是生命活動的主要體現(xiàn)者，釀酒微生物也不例外，因此要研究中國酒曲中微生物與代謝蛋白的功能及其相互關(guān)系，宏蛋白組學(xué)是較為有效的方法。隨著蛋白組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，宏蛋白組學(xué)將會被越來越多的應(yīng)用到酒曲研究中。利用宏蛋白組學(xué)，可建立酒曲宏蛋白質(zhì)組的雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，并將其應(yīng)用于實際生產(chǎn)實踐，指導(dǎo)生產(chǎn)實踐，構(gòu)建以多酶體系為導(dǎo)向的釀造微化物優(yōu)化組合，制備優(yōu)質(zhì)酒曲，并以酒曲的宏蛋白質(zhì)組雙向電泳標(biāo)準(zhǔn)圖譜，判斷酒曲品質(zhì)和生產(chǎn)過程的質(zhì)量穩(wěn)定性。

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