酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用探究

周邦萌　李其美

摘 要：酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA）是較為先進(jìn)的一類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)。在本文中，筆者從其在擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留、有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥殘留、氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用3個(gè)層面論述了ELISA在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，以期為進(jìn)一步完善農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)獻(xiàn)言獻(xiàn)策。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留;ELISA;檢測(cè)

在檢測(cè)技術(shù)中，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA），是較為先進(jìn)的，這一檢測(cè)方法的核心是免疫酶。在早期，該技術(shù)主要使用在病毒以及細(xì)菌的檢測(cè)中。自二十世紀(jì)七十年代起，該技術(shù)又被應(yīng)用在抗原以及抗體的檢測(cè)中。現(xiàn)在，自動(dòng)化免疫技術(shù)日漸成熟，這也提升了ELISA的精準(zhǔn)性，極大地彌補(bǔ)了設(shè)備檢測(cè)、化學(xué)檢測(cè)等方法的不足，因此，該技術(shù)被充分應(yīng)用在食品檢測(cè)中。

1 ELISA概述

目前，ELISA已被廣泛使用在檢測(cè)領(lǐng)域，例如，重金屬檢測(cè)領(lǐng)域、病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域、生物毒素檢測(cè)領(lǐng)域等，它的作用原理就是：先讓固相載體與帶有特意酶標(biāo)記的免疫活性抗原（抗體）結(jié)合，然后使其與樣品中的待測(cè)抗體（抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，再添入酶反應(yīng)底物，即可生成有色產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)顏色變化，達(dá)到檢測(cè)的目的。

針對(duì)于沒(méi)有免疫活性或者具有較低分子量的物質(zhì)而言，要先將該物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，然后再使用ELISA檢測(cè)。按照反應(yīng)途徑，可以把ELISA分為三種：第一種是間接法，第二種是競(jìng)爭(zhēng)性抑制法，第三種是雙抗體夾心法，上述技術(shù)，都有自己的缺點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，要結(jié)合檢測(cè)的具體用途以及檢測(cè)對(duì)象來(lái)做好檢測(cè)技術(shù)的科學(xué)選用。該技術(shù)在食品檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用擴(kuò)大了檢測(cè)的范圍，大大提升了檢測(cè)效率，提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)也降低了檢測(cè)費(fèi)用。在目前的食品檢測(cè)技術(shù)中，ELISA成為首選技術(shù)。

2 ELISA在食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 在擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)應(yīng)用

這種殺蟲(chóng)劑結(jié)構(gòu)與天然除蟲(chóng)菊素相似，當(dāng)下，也有著非常高的使用量。此類(lèi)殺蟲(chóng)劑有著很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，如果長(zhǎng)期食用用含有此類(lèi)農(nóng)藥殘留的食物，可能會(huì)出現(xiàn)慢性中毒，其對(duì)人體有著十分嚴(yán)重的潛在威脅。可應(yīng)用碳二亞胺法偶聯(lián)半抗原等，生成免疫原，如此，即可建立針對(duì)聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，在各項(xiàng)條件都相對(duì)適宜的條件下，此類(lèi)農(nóng)藥的檢出限可降低到0.016 mg/L左右，并且，和其他菊酯農(nóng)藥之間也不會(huì)發(fā)生任何交叉反應(yīng)。學(xué)者余向陽(yáng)等人采用兔抗擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥抗體作為研究對(duì)象，并利用辣根過(guò)氧化物酶對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，研究出來(lái)了能夠同時(shí)檢測(cè)出蔬菜中多種此類(lèi)農(nóng)藥的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，并在某市市場(chǎng)中，隨機(jī)抽取了107個(gè)樣本組織了檢測(cè)，同時(shí)還將這一方法和氣相色譜法進(jìn)行了對(duì)比，得出的結(jié)論是：此法的陽(yáng)性檢出率高達(dá)8.46%，而后者陽(yáng)性檢出率為3.74%[1]。

2.2 在有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)應(yīng)用

目前，在所有農(nóng)藥種類(lèi)中，有機(jī)磷農(nóng)藥的使用量可謂最高，經(jīng)常使用的有辛硫磷、甲胺磷等，此類(lèi)農(nóng)藥多數(shù)是高毒或是劇毒物質(zhì)，能夠?qū)ι矬w內(nèi)的膽堿酯酶活性產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致生物體昏迷、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)等，嚴(yán)重時(shí)可致死。在人體中，此類(lèi)物質(zhì)積累到某種程度后，極易引發(fā)慢性中毒，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)功能紊亂等癥，因而，要引起高度重視。

Kolosova A Y等人利用單克隆抗體，對(duì)甲基對(duì)硫磷進(jìn)行了直接以及間接競(jìng)爭(zhēng)的ELISA測(cè)定，得出的結(jié)論是：直接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定檢出限為0.5 ng/mL，檢測(cè)用時(shí)為1.5 h，間接競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定有著0.08 ng/ml的檢出限，檢測(cè)用時(shí)3.5 h[2]。有學(xué)者選擇DCP作為半抗原，并將其偶聯(lián)于牛血清蛋白，形成多克隆抗體，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定（有機(jī)磷農(nóng)藥），試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：對(duì)硫磷檢出限在0.012 5 μg/ml、敵敵畏有著0.048 μg/mL的檢出限、嘧啶磷有著0.011 6 μg/mL的檢出限，且這3種有害物質(zhì)的樣品回收率都在90%以上[3]。

針對(duì)蔬菜甲胺磷殘留檢測(cè)，學(xué)者王華等人研究出了專(zhuān)門(mén)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑，此試劑在0.01～100 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，有著0.01 μg/mL的最低檢測(cè)限，一般不會(huì)與其他同類(lèi)農(nóng)藥發(fā)生交叉反應(yīng)，且有著非常高的特異性，回收率也較好，高于93.12%，低于102%。如果在4 ℃的溫度下保存該試劑盒，其使用時(shí)間可延長(zhǎng)至半年以上。采取碳二亞胺法免疫兔子，能夠獲得多克隆抗體，從而進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，對(duì)3種有機(jī)磷農(nóng)藥（甲胺磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷）進(jìn)行檢測(cè)得出，對(duì)硫磷的最低檢出限為0.001 mg/mL，甲胺磷和甲基對(duì)硫磷有著0.01 μg/mL的最低檢出限;樣品有著近95%的平均回收率[4]。

2.3 在氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)應(yīng)用

在國(guó)內(nèi)，此類(lèi)農(nóng)藥也是應(yīng)用率較高的一類(lèi)，傷害人體的機(jī)制類(lèi)似于有機(jī)磷農(nóng)藥。針對(duì)土壤中克百威殘留的檢測(cè)，學(xué)者吳慧明等人[5]，研究出了ELISA試劑盒（直接競(jìng)爭(zhēng)），該試劑在0.01～10 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，有著0.01 mg/L的最低檢測(cè)限。張奇等人研制出了速滅威的兔抗血清，針對(duì)速滅威，創(chuàng)建了可定性、定量檢測(cè)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，此法的線性范圍是1～10 000 μg/L，檢出限是0.08～0.10 μg/L，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的速滅威殘留檢測(cè)中[6]。

3 結(jié)論及展望

農(nóng)產(chǎn)品藥物殘留分析檢測(cè)技術(shù)是針對(duì)于復(fù)雜混合物痕量組分的一種檢測(cè)技術(shù)。成本高、難度大、儀器化程度高，大大增加了農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析的難度，因此，各種敏感度高、精準(zhǔn)度高、檢測(cè)速度快的試劑盒應(yīng)運(yùn)而生，成為確保無(wú)殘留的關(guān)鍵措施。在農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥檢測(cè)方面，ELISA已得到了一定的應(yīng)用，該技術(shù)靈敏、方便、特異性強(qiáng)、分析容量大、可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品、分析成本不高且儀器化程度較低，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面、復(fù)雜樣品藥殘檢測(cè)方面的應(yīng)用前景非常廣闊。

現(xiàn)在，關(guān)于酶聯(lián)免疫試劑盒的研制，國(guó)外已經(jīng)發(fā)展的比較成熟，試劑盒幾乎涵蓋了所有常用的農(nóng)藥種類(lèi)。在國(guó)內(nèi)，關(guān)于酶聯(lián)免疫試劑盒的研制，起步相對(duì)晚一些，農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒市場(chǎng)被外國(guó)公司占領(lǐng)，大大增加了國(guó)內(nèi)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的成本，阻礙了試劑盒的使用。另外，ELISA建立的基礎(chǔ)是抗體抗原的特異性反應(yīng)，對(duì)于一些結(jié)構(gòu)相類(lèi)似的化合物而言，這種特異性存在一定的交叉反應(yīng)，這些交叉反應(yīng)會(huì)讓檢測(cè)效率受到很大影響，當(dāng)出現(xiàn)未知農(nóng)藥樣品時(shí)，該技術(shù)并不適用。在農(nóng)業(yè)殘留檢測(cè)工作實(shí)踐中，目前最常用的是多克隆抗體，其制備簡(jiǎn)單，成本低，但是其在檢測(cè)效果及特異性方面不如單克隆抗體，但單克隆抗體的制備成本高、難度大，仍需要進(jìn)行深入地研究。

參考文獻(xiàn)

[1]余向陽(yáng)，駱愛(ài)蘭，劉媛，等.擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA建立及初步應(yīng)用[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（3）：249-252.

[2]Kolosov A Y， PARKA J H， EREMIN S A， et al.Comparative study of three immunoassays based on monoclonal antibodies for detection of the pesticide parathion-methyl in real samples[J].Analytica Chimica Acta， 2004，511（2）：323-331.

[3]TANG J S， ZHANGM， CHENG G H， et al. Development of IC-ELISA for detection of organophosphorus pesticides in water[J].Journal of Environmental Science and Health Part B： Pesticides Food Contaminantsand Agricultural Wastes，2008，43（8）：707-712.

[4]王華，熊漢國(guó)，張丁聯(lián)，等.甲胺磷殘留檢測(cè)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2007（4）：122-126.

[5]吳慧明，楊挺，朱國(guó)念.土壤中克百威殘留檢測(cè)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒的研制[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)，2003，29（6）：634-638.

[6]張奇，李鐵軍，朱曉霞，等.氨基甲酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑速滅威酶聯(lián)免疫吸附分析方法研究[J].分析化學(xué)，2006，34（2）：178-182.