利用表面活性劑超聲波輔助提取胡柚皮黃酮的研究

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶526061）

常山胡柚是常山特有的一種柑桔地方品種，是自然界中的蕓香科植物柚與甜橙的天然雜交品種，具有獨(dú)特的風(fēng)味[1]。目前，胡柚在加工產(chǎn)業(yè)中主要是將果肉制成果汁型飲料以及果脯，廢棄大量的果皮果渣，而胡柚皮中含有豐富的果膠、多酚類化合物包括黃酮類物質(zhì)以及揮發(fā)性精油等，適合將其進(jìn)行開發(fā)利用，提高胡柚的整體價(jià)值[2-3]。由于合成抗氧化劑對(duì)人體存在著一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)，故人們對(duì)黃酮等天然抗氧化劑越來越重視，需求量也逐年增大[4]。傳統(tǒng)上，用水蒸氣蒸餾法、索式提取法、回流提取法等方法提取時(shí)工序繁雜，耗時(shí)長(zhǎng)，成分復(fù)雜并且損失大[5]。對(duì)胡柚皮用超聲輔助提取或者表面活性劑協(xié)同微波輔助提取的研究報(bào)道較常見[6-9]，而將超聲和表面活性劑結(jié)合起來提取胡柚皮黃酮的研究還鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)采用表面活性劑與超聲波協(xié)同輔助提取胡柚皮中的黃酮類物質(zhì)，能夠更大程度上使原料中的提取物溶解在溶液中，能有效地提高提取效率[10-13]。利用Design-Expert.V8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)[14-16]，并在優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果上進(jìn)行驗(yàn)證得出最佳提取條件，本試驗(yàn)研究旨在為胡柚皮的進(jìn)一步綜合利用提供參考。

1 材料與儀器

胡柚：浙江省衢州市常山縣；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：分析純，山東西亞化學(xué)股份有限公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl benzene sulfonate，LAS）、吐溫20（Tween-20）、聚乙二醇400（polyethylene glycol，PEG400）：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇、無水乙醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；蘆?。?8%，成都曼思特生物科技有限公司。

SK8200H超聲波清洗器：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；AUY120電子分析天平：日本島津公司；DHG-9070B數(shù)顯電熱恒溫干燥箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；TD3-800B臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 胡柚皮中總黃酮的提取工藝流程

胡柚→清洗→剝皮切塊→烘箱干燥（60℃）→粉碎→過篩→稱量→表面活性劑+乙醇溶液浸提→超聲輔助提取→離心→抽濾→顯色定容→吸光度測(cè)定→總黃酮提取率計(jì)算

2.2 操作要點(diǎn)

將胡柚皮切成小塊，放進(jìn)烘箱中設(shè)置60℃烘干至恒重，然后用粉碎機(jī)將其打成粉末狀后過60目篩。參考文獻(xiàn)[17-20]配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液、60%乙醇溶液等溶液，并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在100 mL的碘量瓶中放入稱好的1 g胡柚皮粉，按照設(shè)定的料液比加入一半體積的表面活性劑溶液和乙醇溶液，放置在已提前40℃恒溫的超聲器中，超聲一定時(shí)間后取出，用半微量抽濾裝置進(jìn)行抽濾。將濾渣和另外一半體積的表面活性劑溶液和乙醇溶液搖勻，繼續(xù)超聲相同時(shí)間，再抽濾，合并兩次抽濾液，搖勻。將混合均勻的濾液倒入10 mL的離心管中，設(shè)置離心機(jī)以4 000 r/min離心15 min后，用吸量管準(zhǔn)確移取上層離心液0.5 mL于25 mL比色管中，進(jìn)行顯色處理。以樣品提取液空白進(jìn)行調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)510 nm處依次測(cè)定吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出提取出來后總黃酮的質(zhì)量濃度c（mg/mL），從而計(jì)算出總黃酮提取率。平行3次重復(fù)試驗(yàn)，取其均值。提取率計(jì)算公式：

式中：c為樣品系列濃度梯度顯色液中所含總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為溶液稀釋倍數(shù)；m為稱取的胡柚皮粉末質(zhì)量，g；1 000為單位換算系數(shù)。

2.3 單因素試驗(yàn)

單因素研究時(shí)，設(shè)計(jì)表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，超聲時(shí)間為5 min，功率為500 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶20（g/mL），在提取溫度為40℃下進(jìn)行輔助提取。當(dāng)研究到相應(yīng)因素時(shí)，改變其因素值進(jìn)行研究，其他因素條件保持不變。在探究每一個(gè)單因素后，將其較佳的條件替換后再進(jìn)行下一個(gè)因素探究。

2.3.1 表面活性劑類型的影響

準(zhǔn)確稱取1 g的胡柚皮粉4份，按照2.2試驗(yàn)方法，計(jì)算出總黃酮提取率。探究不同種類表面活性劑：吐溫 20（Tween-20）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（LAS）、聚乙二醇 400（PEG400）對(duì)提取率的影響。

2.3.2 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g的胡柚皮粉6份，參照2.2的試驗(yàn)方法，計(jì)算出總黃酮提取率。探究加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的 SDS對(duì)提取率的影響。

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g的胡柚皮粉6份，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的條件下，參照2.2中的試驗(yàn)方法，計(jì)算出總黃酮提取率。探究超聲時(shí)間為 5、10、15、20、25、30 min對(duì)提取率的影響。

2.3.4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，超聲時(shí)間為25 min條件下，參照2.2中的試驗(yàn)方法，計(jì)算出總黃酮提取率。探究50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液對(duì)提取率的影響。

2.3.5 料液比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g的胡柚皮粉5份，在SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，超聲時(shí)間為25 min，70%乙醇溶液條件下，參照2.2中的試驗(yàn)方法，計(jì)算出總黃酮提取率。探究料液比為 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）時(shí)對(duì)提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

綜合單因素試驗(yàn)操作與結(jié)果，選取SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比等4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得出優(yōu)化工藝條件，設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factor level design

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

由圖1可見，在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為 y=12.825x-0.007 1，即：A=12.825 c-0.007 1，決定系數(shù)R2為0.999 2，表明蘆丁溶液與吸光度在選取的試驗(yàn)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

3.2 單因素試驗(yàn)對(duì)提取率的影響

3.2.1 表面活性劑類型對(duì)提取率的影響

不同種類表面活性劑對(duì)總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 不同種類表面活性劑對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of different kinds of surfactants on extraction rate

由圖2可知，加入不同類型表面活性劑由于破壞細(xì)胞膜能力不一樣使之浸出物也存在差異性，故在超聲輔助提取中提取率也存在差異，PEG400的提取率最低，SDS的提取率最高，LAS次之，因此試驗(yàn)選擇SDS作為提取胡柚皮總黃酮的表面活性劑。

3.2.2 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響見圖3。

圖3 SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of SDS quality score on extraction rate

由圖3可知，在0.5%～3.0%范圍內(nèi)隨著SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)SDS用量達(dá)到2.5%時(shí)，提取率最大，大于2.5%時(shí)提取率降低。由于表面活性劑到達(dá)一定濃度程度后，對(duì)總黃酮的增溶作用不再增強(qiáng)，溶液中形成的膠束數(shù)量呈現(xiàn)飽和狀態(tài)，因此試驗(yàn)選擇SDS最佳用量為2.5%。

3.2.3 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate

由圖4可知，胡柚皮中總黃酮提取率隨超聲時(shí)間而逐漸增加，當(dāng)達(dá)到25 min時(shí)達(dá)到最大值，超過25 min后，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。超聲波輔助提取會(huì)產(chǎn)生的空化效應(yīng)使得原料中更多黃酮溶解到乙醇溶液中，但超聲時(shí)間過長(zhǎng)，部分黃酮結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，同時(shí)有其他雜質(zhì)溶出，使得黃酮提取率降低。因此試驗(yàn)選擇超聲輔助提取最佳時(shí)間為25 min。

3.2.4 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

乙醇濃度對(duì)提取率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate

由圖5可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)提取率達(dá)到最大值，超過此濃度后，提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。隨著乙醇濃度的增加，植物細(xì)胞的通透性提高，有更多的黃酮溶于乙醇溶液中，但超過一定限度后，高濃度的乙醇對(duì)其他物質(zhì)影響更大，從而溶解出更多的醇溶親脂性雜質(zhì)，影響總黃酮提取率。因此試驗(yàn)選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

3.2.5 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)提取率的影響見圖6。

圖6 料液比對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of raw material and solution ratio on extraction rate

由圖6可知，隨著提取溶液量的增加，總黃酮提取率先增加，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)提取率最大，隨后，提取率逐漸減少。當(dāng)溶液量增大時(shí)，樣品粉末與溶劑的接觸面濃度差變大，導(dǎo)致傳質(zhì)速率增加，黃酮類化合物更容易溶出；但濃度差到達(dá)一定程度后，其他非黃酮類化合物也會(huì)相繼溶出，雜質(zhì)增多，溶液黏度發(fā)生改變，影響了黃酮的溶出，從而提取率降低。因此試驗(yàn)選擇最佳料液比為1∶30（g/mL）。

3.3 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

使用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)表2中響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到胡柚皮中總黃酮提取率（Y），SDS質(zhì)量濃度（A），超聲時(shí)間（B），乙醇濃度（C），料液比（D）的二次回歸方程為：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.098AB-0.036AC-0.023AD+0.000 4BC-0.087BD+0.020CD+0.000 0166 7A2-0.037B2-0.062C2-0.057D2。回歸模型的方差分析如表3所示。

從表 3 可知其自變量 A，B，C，D，AC，BD，B2，C2，D2的 P值均小于0.01，表明單因素A、B、C、D交互項(xiàng)AC、BD 與二次項(xiàng) B2、C2、D2都對(duì)試驗(yàn)具有極顯著影響，而其他項(xiàng) AB、AD、BC、CD、A2則影響不顯著。因此，二次多項(xiàng)回歸方程可修正為：Y（%）=1.91-0.022A+0.032B+0.026C+0.063D-0.036AC-0.087BD-0.037B2-0.062C2-0.057D2，對(duì)胡柚皮中總黃酮提取率的大小影響順序?yàn)椋毫弦罕龋―）＞超聲時(shí)間（B）＞乙醇濃度（C）＞SDS質(zhì)量濃度（A）。模型的R2=0.952 0，校正決定系數(shù) R2（adj）=0.903 9＞0.80 試驗(yàn)誤差較小，表明模型擬合度較好，試驗(yàn)可操作。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

續(xù)表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

3.4 各因素交互作用分析

經(jīng)過分析各因素間的交互作用，剔除不顯著項(xiàng)，顯著項(xiàng)如圖7所示。

圖7 兩因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of two-factor interaction

乙醇濃度的曲線比SDS質(zhì)量濃度的曲線走勢(shì)更為陡峭，SDS質(zhì)量濃度的曲線走勢(shì)平緩。乙醇濃度對(duì)提取率的影響比SDS質(zhì)量濃度更為顯著。二者等高線圖形狀呈現(xiàn)橢圓形，表明二者具有顯著的交互作用，且在SDS濃度為2.0%～2.25%，乙醇濃度為75%～80%的區(qū)域內(nèi)提取率取得最大值。料液比的曲線比超聲時(shí)間走勢(shì)更為陡峭。料液比對(duì)提取率的影響比提取時(shí)間更為顯著。二者等高線圖形狀呈現(xiàn)橢圓形，表明二者具有顯著的交互作用，且在超聲時(shí)間為20 min～25 min，料液比為 1 ∶35（g/mL）～1 ∶40（g/mL）的區(qū)域內(nèi)提取率取得最大值。此結(jié)果分析與方差分析結(jié)果相一致。

3.5 驗(yàn)證優(yōu)化條件

根據(jù)模型擬合得到胡柚皮中總黃酮的最佳提取工藝條件在SDS質(zhì)量濃度為2.0%，超聲時(shí)間為21.9 min，乙醇濃度為 76.54%，料液比為 1 ∶40（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率可達(dá)到2.001%。從實(shí)際可操作角度考慮，將最佳提取工藝條件修正為SDS質(zhì)量濃度為2.0%，超聲時(shí)間為22 min，乙醇濃度為77%，料液比為1∶40（g/mL），在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，最后得到胡柚皮中總黃酮提取率為1.973 1%。與模型擬合得到的預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.4%，從而證明該響應(yīng)面優(yōu)化模型所得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，工藝條件可行性較高，具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

胡柚皮一直作為垃圾被廢棄，其皮中的營(yíng)養(yǎng)成分豐富，經(jīng)加工利用可以大大提高胡柚皮的應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)通過在乙醇溶液提取胡柚皮總黃酮的基礎(chǔ)上，采用表面活性劑超聲波輔助提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果表明此法提取能有效地提高胡柚皮總黃酮的提取率。經(jīng)過優(yōu)化驗(yàn)證，最佳提取工藝條件為：SDS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，超聲時(shí)間為22 min，乙醇濃度為 77%，料液比為 1 ∶40（g/mL），提取溫度為40℃。在此條件下，胡柚皮中總黃酮提取率可達(dá)1.973 1%。試驗(yàn)期望能為進(jìn)一步研究胡柚皮黃酮的提取提供一定的理論基礎(chǔ)，將胡柚皮變廢為寶，提高胡柚的整體價(jià)值。