響應(yīng)面優(yōu)化紅藍(lán)草總酚酸的提取及其抗氧化活性研究

韋正，賴紅芳，彭麗娟，覃國樂，黃秀香

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州546300）

紅藍(lán)草[Peristrophe baphica（Spreng.）Bremek，PB]是爵床科觀音草屬植物，又稱為紅絲線，有紅藍(lán)、山藍(lán)、觀音草、野靛青之稱[1]，主要分布在我國的廣西、廣東、云南、海南等省區(qū)，采收時一般是在夏季，它的全草具有藥用價值，具有涼血止血、消腫止痛、清肺止咳[1-2]的功效。在民間，毒蛇咬傷、中暑、扁桃體炎、傷風(fēng)、氣喘、小兒驚風(fēng)均用紅藍(lán)草來治療[3]。在食品上，它的汁液是做“紅色糯米飯”的原料，工業(yè)上用來制作“紅蘭酒”[4]。紅藍(lán)草主要含有酚酸類、黃酮類、多糖、生物堿、三萜、甾體及其苷類、苯丙素類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[5]，其中酚酸類物質(zhì)（原兒茶酸、5-羥基異香草酸、對乙烯基愈創(chuàng)木酚等）具有一定的抗氧化活性[6]。

紅藍(lán)草在少數(shù)民族地區(qū)用作為“五色糯米飯”其中的一種天然的有機染料，其亦為明顯藥理作用的中草藥[7-9]，其酚酸類的提取工藝及抗氧化活性研究未見報道。前期預(yù)試驗及文獻整理研究發(fā)現(xiàn)，紅藍(lán)草中亦含有酚酸類有效成分[5]，本試驗對紅藍(lán)草總酚酸進行研究，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法（box-behnken design，BBD）模型設(shè)計優(yōu)選出較佳的總酚酸的提取工藝，采用體外抗氧化活性評價方法進行試驗，以期為植物染料紅藍(lán)草的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅藍(lán)草：采摘于廣西宜州市劉三姐鄉(xiāng)六妹村，經(jīng)河池學(xué)院覃國樂副教授鑒定為爵床科觀音草屬Peristrophe baphica（Spreng.）Bremek紅藍(lán)草的莖葉。將紅藍(lán)草藥材洗凈、曬干、粉碎、過五號篩，放入干燥缸保存，備用。

1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）：美國 Sigma公司；三氯化鐵、鐵氰化鉀、十二烷基硫酸鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；沒食子酸對照品（純度均≥98%）：成都曼斯特生物制品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Cary 8453 UV-Vis二極管陣列分光光度計：美國Agilent公司；電子-分析天平FA1004B：上海越平科學(xué)儀器有限公司；WKH-1.7-A型熱風(fēng)循環(huán)烘箱：青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；RH-800型高速多功能粉碎機：浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試液的制備

精密稱取紅藍(lán)草藥材粉末適量，放入規(guī)定純度的乙醇一定體積，在適宜溫度下回流一段時間后得到提取液，過濾，稀釋后即得到所需供試液。

1.3.2 紅藍(lán)草總酚酸的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取干燥好的沒食子酸對照品適量，配制成0.20 mg/mL濃度的溶液，備用。

分別精密吸取適量沒食子酸對照品放置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至5 mL，搖勻后暗處放置10 min，然后加入現(xiàn)配制2 mL的0.3%十二烷基硫酸鈉溶液和1 mL的0.5%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵（體積比1∶1）的混合液，搖勻后暗處放置20 min，再用0.10 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，搖勻后在暗處放置30 min，以顯色劑為空白溶液，在最大波長處測定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=52.55C+0.129 9，R2=0.999 8，總酚酸與沒食子酸計，在0.004 896 mg/mL～0.014 688 mg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.3 單因素試驗考察

稱取適量藥材粉末，固定回流溫度為70℃、回流時間為90 min、乙醇濃度為70%，按順序加入液料比為 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1、40 ∶1（mL/g）的條件下提取紅藍(lán)草總酚酸，測定總酚酸得率，選擇適宜液料比。確定最優(yōu)的液料比后依次改換其余單因素，提取溶媒乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%，回流提取溫度分別為 40、50、60、70、80、90℃，回流提取時間分別為 30、60、90、120、150、180min。確定前四者的最優(yōu)條件，再考察提取次數(shù)1、2、3次對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響。

1.3.4 星點試驗設(shè)計-效應(yīng)面法

參照文獻[10-14]，根據(jù)單因素考察及星點試驗的設(shè)計原理，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以紅藍(lán)草總酚酸得率為響應(yīng)值，進行Box-Behnken Design響應(yīng)面法試驗，優(yōu)選紅藍(lán)草總酚酸的最優(yōu)工藝條件。響應(yīng)面試驗的因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗的因素與水平Table 1 The response surface experiment factors and levels

1.3.5 紅藍(lán)草總酚酸抗氧化活性研究

根據(jù)最佳提取工藝條件及參考文獻方法，進行抗氧化活性評價。參照文獻的試驗操作[15]，精密稱取紅藍(lán)草藥材粉末適量，在最優(yōu)工藝條件下提取紅藍(lán)草總酚酸，參照文獻[16-17]進行濃縮，減壓干燥得到干浸膏，稱取浸膏配制供試品溶液，依次稀釋成0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL的系列溶液，同時配制DPPH乙醇溶液0.3 mmol/L，備用。

1.3.5.1 紅藍(lán)草總酚酸清除DPPH自由基活性測定

參照文獻[16]，分別量取上述不同濃度提取物供試品溶液2.0 mL移置于試管中，并依次加入DPPH溶液6.0 mL，并避光反應(yīng)30 min后于525 nm處測定吸光度，記為A1；取水2.0 mL置于10.0 mL試管中，作為空白管，其余操作同樣品管，測定吸光度，記為A2；另分別量取不同濃度提取物供試品溶液2.0 mL，加入60%乙醇6.0 mL，作為對照管，反應(yīng)30 min后于525 nm處測定吸光度，記為A3。采用Vc作為對照同法操作，測定吸光度記為A。以上各組重復(fù)3次，取其平均值，按下式計算其清除率。

清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.3.5.2 紅藍(lán)草總酚酸還原能力的測定

參照文獻[18-19]，分別量取上述不同濃度提取物供試品溶液2.0 mL移置于試管中，然后按照王雨等[19]測定野桂花蜜的總酚酸的還原能力的方法，依次配好溶液，混勻。在700 nm波長處測定其吸光度，以蒸餾水做空白，采用Vc作為對照同法操作，測定吸光度。以上各組重復(fù)3次，取其平均值。

1.3.5.3 紅藍(lán)草總酚酸清除羥自由基（·OH）活性測定

參照文獻[20]，分別取依次編號的具塞比色管，加入0.1 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）和0.4 mL的5 mmol/L的鄰二氮菲溶液，然后加入0.12 mL的7.5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，充分搖勻。再分別量取上述不同濃度提取物供試品溶液2.0 mL和0.4 mL的6 mmol/L雙氧水溶液，振蕩后接著加入0.2 mL的1%雙氧水溶液，然后定容至10.0 mL，在37℃的水浴鍋中靜置30 min，在532 nm波長處測定吸光度，空白組為蒸餾水，采用Vc作為對照同法操作，測定吸光度。以上各組重復(fù)3次，取其平均值。

按下式計算其清除率。

羥自由基清除率/%=（A1-A2）/（A3-A2）×100

式中：A1為樣品溶液+雙氧水溶液的吸光度；A2為蒸餾水對照+雙氧水溶液的吸光度；A3為用蒸餾水代替樣品+雙氧水溶液空白組的吸光度。

1.3.5.4 紅藍(lán)草總酚酸清除超氧陰離子自由基（·O2-）活性測定

參照文獻[19-21]，分別取依次編號的具塞比色管，加入4.5 mL的50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），放置于25℃水浴鍋中20 min，再分別量取上述不同濃度提取物供試品溶液2.0 mL，然后按照王雨等[19]測定野桂花蜜的總酚酸清除超氧陰離子自由基（·O2-）活性測定的方法，依次配好溶液，混勻，在325 nm處測定吸光度，空白組為蒸餾水，采用VC對照品作為陽性對照。以上各組重復(fù)3次，取其平均值。

按下式計算其清除率。

超氧陰離子自由基清除率/%=（A0-A1）/A1×100

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0作圖；采用Design-Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken法設(shè)計優(yōu)化試驗方案并對所得數(shù)據(jù)進行處理，獲取回歸模型及最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅藍(lán)草總酚酸提取的單因素試驗

2.1.1 液料比對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響

液料比對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響見圖1。

圖1 液料比對得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid radio on on total phenolic acids extraction rate

由圖1可知，液料比對紅藍(lán)草總酚酸提取的效果呈上升趨勢，在液料比為30∶1（mL/g）時，紅藍(lán)草總酚酸的得率最高，然后慢慢降低，則應(yīng)該選擇30∶1（mL/g）的液料比進行提取。

2.1.2 乙醇濃度對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響

乙醇濃度對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total phenolic acids extraction rate

由圖2可知，乙醇濃度對紅藍(lán)草酚酸提取的效果呈上升趨勢，在乙醇濃度為70%時，紅藍(lán)草總酚酸的得率達(dá)到最高，然后慢慢下降，則應(yīng)該選擇70%的乙醇濃度進行提取。

2.1.3 提取溫度對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響

提取溫度對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total phenolic acids extraction rate

由圖3可知，提取溫度對紅藍(lán)草總酚酸提取的效果呈上升趨勢，在溫度70℃時，紅藍(lán)草總酚酸的百分含量最高，然后慢慢下降，則應(yīng)該選擇溫度為70℃進行提取。

2.1.4 提取時間對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響

提取時間對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響見圖4。

圖4 提取時間對得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on total phenolic acids extraction rate

由圖4可見，時間因素對總酚酸的提取效果在90 min以前呈上升狀態(tài)，在90 min時，總酚酸的百分含量達(dá)到最高，然后慢慢下降，則應(yīng)該選擇時間為90 min進行提取。

2.1.5 提取次數(shù)對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響

提取次數(shù)對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響見圖5。

從圖5可以看出，在確定前面的條件下，提取次數(shù)對總酚酸得率未有顯著差異，提取次數(shù)越多，得率越高，但提取液的體積越大，影響到后續(xù)的濃縮工藝，故此次選擇提取次數(shù)為1次。

2.2 紅藍(lán)草總酚酸提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

圖5 提取次數(shù)對得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on total phenolic acids of extraction rate

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取溶媒液料比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間為響應(yīng)變量，以紅藍(lán)草總酚酸的得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design模型（中心復(fù)合模型）設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。其響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，回歸模型參數(shù)檢驗見表3。

表2 紅藍(lán)草總酚酸的提取響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果（n=3）Table 2 Total phenolic acid of the PB extraction design and response surface experiment results（n=3）

采用Design expert 8.0.6軟件分析，應(yīng)用Quadratic模型，總酚酸得率對表2進行數(shù)據(jù)擬合得如下函數(shù)關(guān)系式。

Y=-546.933 09+2.661 96X1+11.744 43X2+2.04022X3+1.238 22X4+0.013 487X1X2-4.567 25×10-3X1X3+2.466 67×104X1X4+1.748 75×103X2X3+3.347 58×103X2X4-9.148 75×104X3X4-0.059 725X12-0.088 823X22-0.013 969X32-7.854 06×103X42

回歸模型參數(shù)檢驗見表3。

表3 回歸模型參數(shù)檢驗Table 3 Parameter estimate of regression model

從方程式及表3的方差分析可知，該回歸模型極顯著（P＜0.000 1），該模型的相關(guān)系數(shù)為 R2=0.925 6，說明響應(yīng)面值的變化有92.56%來源于所選的變量，從P值及F值可以看出，影響因子的主效應(yīng)大小為：X1液料比＞X2乙醇濃度＞X3提取溫度＞X4提取時間。模型確定的最佳工藝為液料比為27.37∶1（mL/g），乙醇濃度為70.96%，提取溫度為70.18℃，提取時間為89.93 min。

2.2.2 兩因素交互作用響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，通過觀察響應(yīng)面的變化情況和稀疏程度可直觀地反映各因素相互作用對紅藍(lán)草總酚酸得率的影響，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)響應(yīng)面的坡度越陡峭呈現(xiàn)扁圓形或馬鞍形時，則表示兩因子交互作用越顯著。

圖6 兩因素交互作用對總酚酸得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of interaction of two factors on polyphenol yield

2.2.3 最佳條件的確定和模型的驗證

運用采用Designexpert8.0.6軟件分析，應(yīng)用Quadratic模型，對紅藍(lán)草總酚酸得率的二次多項模型實行優(yōu)化，選出了最佳工藝參數(shù)：模型確定的最佳工藝為液料比為27.37∶1（mL/g），乙醇濃度為70.96%，提取溫度為70.18℃，提取時間為89.93 min。結(jié)合生產(chǎn)實際，確定紅藍(lán)草總酚酸的提取條件為：液料比為28∶1（mL/g），乙醇濃度為71%，提取溫度為70℃，提取時間為90 min，在該條件下經(jīng)過驗證得到的紅藍(lán)草含量為31.574 4 mg/g，與預(yù)測值31.860 6 mg/g接近，表明該工藝合理，該模型可靠。

2.3 紅藍(lán)草總酚酸的抗氧化活性研究

2.3.1 紅藍(lán)草總酚酸清除DPPH自由基活性的測定

紅藍(lán)草總酚酸清除DPPH自由基活性的測定見圖7。

圖7 對DPPH自由基的清除能力Fig.7 Total phenolic acid of the PB removal activity of DPPH free radical

由圖7可知，低濃度的紅藍(lán)草總酚酸、VC溶液，其DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而升高，但紅藍(lán)草總酚酸的清除率較弱。

2.3.2 紅藍(lán)草總酚酸的還原能力的測定

紅藍(lán)草總酚酸的還原能力的測定見圖8。

圖8 不同濃度提取液的還原能力Fig.8 Total phenolic acid of the PB reduction ability at different concentrations

由圖8可知，紅藍(lán)草總酚酸和VC的還原能力隨著濃度的升高，其吸光度值也逐漸升高，還原能力也逐漸增強，但紅藍(lán)草的還原能力變化不大，VC的還原能力比紅藍(lán)草強。

2.3.3 紅藍(lán)草總酚酸清除羥基自由基（·OH）的能力測定

圖9 對羥自由基的清除能力Fig.9 The removal of total phenolic acid of the PB hydroxyl free radical ability

紅藍(lán)草總酚酸清除羥基自由基（·OH）的能力測定見圖9。由圖9可知，紅藍(lán)草總酚酸和VC清除羥基自由基的能力隨濃度的升高而逐漸增強，變化比較明顯，但VC的羥基自由基清除率始終高于紅藍(lán)草的羥基自由基清除率。

2.3.4 紅藍(lán)草總酚酸清除超氧陰離子自由基能力的測定

紅藍(lán)草總酚酸的清除超氧陰離子自由基能力測定見圖10。

圖10 對超氧陰離子的清除能力Fig.10 Total phenolic acid of the PB removal ability on superoxide anion

由圖10可知，紅藍(lán)草和VC清除超氧基自由基的能力隨濃度的升高而逐漸增強，變化比較明顯，紅藍(lán)草和VC的超氧基自由基清除率相差較大，VC的超氧基自由基清除率始終高于紅藍(lán)草的超氧基自由基清除率。

3 結(jié)論

近年來文獻對紅藍(lán)草色素穩(wěn)定性的研究較多，對該物質(zhì)的其他化學(xué)成分研究較少，研究欠缺系統(tǒng)性和深入性。本試驗中對紅藍(lán)草中總酚酸進行研究，這對紅藍(lán)草的資源開發(fā)提供了理論依據(jù)。本文通過單因素試驗的考察，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗優(yōu)化紅藍(lán)草總酚酸提取工藝，即液料比為28∶1（mL/g），乙醇濃度為71%，提取溫度為70℃，提取時間為90 min，在該條件下紅藍(lán)草總酚酸含量為31.574 4 mg/g，與預(yù)測值31.860 6 mg/g接近，表明該方法可行，在此條件下可用于紅藍(lán)草總酚酸的提取。采用體外抗氧化活性評價方法對紅藍(lán)草總酚酸提取液研究，發(fā)現(xiàn)其隨著濃度增加，其清除能力逐漸增強，可作為自由基清除劑和天然抗氧化劑，具有一定的應(yīng)用價值。