微波-超聲波協(xié)同輔助優(yōu)化陽荷多糖提取工藝及抗氧化性分析

（1.陜西理工大學陜西省催化基礎與應用重點實驗室，陜西漢中723000；2.陜西理工大學化學與環(huán)境科學學院，陜西漢中723000）

陽荷（Zingiber strioatum），又名野山姜、瓣姜、野姜等，屬姜科姜屬多年生草本植物，在我國主要分布于云南、貴州、廣西、四川、湖南和湖北等地[1]。陽荷是一種藥食同源植物，其嫩芽、莖果均可食用，富含氨基酸[2]、蛋白質(zhì)[3]、微量元素[4]、膳食纖維和黃酮類物質(zhì)[5-6]等，具有抗氧化、抗菌、降血糖、活血調(diào)經(jīng)和消腫解毒等功效，藥用價值非常高。目前國內(nèi)外對陽荷資源的研究主要集中于紅色素提取工藝及穩(wěn)定性研究、膳食纖維多糖、抑菌活性、氨基酸和蛋白質(zhì)的分類及微量元素含量等方面[7]。多糖是單糖通過脫水形成的糖苷鏈，是一切有機體必不可少的生物聚合物，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗病毒、抗氧化、降血脂等功效[8]。微波-超聲波協(xié)同輔助提取多糖，將微波和超聲波的優(yōu)點相結(jié)合，促使植物多糖從植物細胞內(nèi)釋放速度更快、釋放效率更高，具有提取時間短、提取溫度低和提取效率高等優(yōu)點[9-11]。目前，微波-超聲波協(xié)同輔助提取陽荷中的多糖及抗氧化活性研究鮮有報道。本研究以陜南野生的陽荷為原材料，采用微波-超聲波協(xié)同輔助提取陽荷多糖，通過響應面分析法優(yōu)化其提取工藝；借助體外抗氧化模型進一步評價陽荷多糖的抗氧化性，以期為秦巴野生陽荷資源的進一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

陽荷：采集于漢中市漢臺區(qū)，60℃恒溫干燥箱中烘干，冷卻至25℃后粉碎，過40目篩，脫脂（石油醚浸泡24 h），風干后密封備用。

雙氧水（30%）、葡萄糖、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸（均為分析純）：國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；鄰二氮菲、硫酸亞鐵、DPPH、三羥基氨基甲烷（Tris）、沒食子酸（鄰苯三酚）、ABTS、抗壞血酸（VC）：均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

EL104型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；JXL-2S-6A恒溫水浴鍋：金壇市金祥龍電子有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計：日本島津公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱：天津TST儀器有限公司；KQ-7200D型超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；TDL-5-A型臺式離心機：江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 陽荷中多糖的提取及測定

準確稱取一定量脫脂陽荷樣品，準確加入一定體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH7），設定微波-超聲波輔助提取條件，進行提取、離心得到多糖提取液。依據(jù)苯酚-硫酸法測定陽荷中的多糖含量，其計算公式如下：

陽荷多糖得率/%=[（n×C×V）/m]×100

式中：m為準確稱取多糖樣品質(zhì)量，g；n為稀釋倍數(shù)；C為待測樣品的濃度，mg/mL；V為準確移取待測樣品的體積，mL。

依據(jù)文獻方法[12]繪制葡萄糖溶液標準曲線，得到標準線性回歸方程為：y=10.859x+0.105 2，R2=0.999 2。

1.3.2 單因素試驗與陽荷多糖得率的影響

依據(jù)1.3.1試驗方法，考察緩沖溶液pH值、微波功率、微波時間、超聲功率、提取時間、提取溫度和料液比對陽荷多糖得率的影響。在試驗過程中，各因素的考察范圍分別為：緩沖溶液 pH 值 4、5、6、7、8；微波功率 100、200、300、400、500 W；微波時間 1、2、3、4、5 min；超聲功率 280、350、420、490、560 W；提取時間5、10、15、20、25 min；提取溫度 30、40、50、60、70 ℃；料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）。

1.3.3 響應面分析試驗與陽荷多糖提取工藝的優(yōu)化

在試驗過程中，固定微波功率200 W，微波時間3 min，依據(jù)Box-benhnken中心組合試驗設計原理，以超聲功率、提取時間、提取溫度和料液比4個因素為自變量，設計四因素三水平共計27個試驗點的響應面分析試驗，其因素與水平詳見表1。

表1 響應面分析因素的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.4 陽荷多糖的抗氧化性分析

依據(jù)文獻[13]的方法，測定陽荷多糖清除ABTS+自由基能力；依據(jù)文獻[14]方法，測定陽荷多糖清除羥基自由基（·OH）的能力；依據(jù)文獻[15]方法評價陽荷多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力；依據(jù)文獻[16]方法評價陽荷多糖清除DPPH自由基能力。配置同濃度的抗壞血酸溶液，相同的試驗條件下進行對照試驗，其清除率計算公式如下：

式中：A0為自由基與緩沖溶液的吸光度值；A樣品為陽荷多糖和自由基混合溶液的吸光度值；Ai為陽荷多糖與蒸餾水溶液的吸光度值；A損傷為過氧化氫與緩沖溶液的吸光度值；A未損為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗對陽荷多糖得率的影響

2.1.1 緩沖溶液pH值影響

以料液比1∶30（g/mL），微波功率200 W，微波處理1 min后，設定超聲功率350 W，提取溫度60℃繼續(xù)超聲輔助提取15 min后，研究檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液的pH值對陽荷多糖得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 pH值對多糖得率的影響Fig.1 Effect of pH value on the polysaccharide extraction rate

由圖1可知，隨著檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液pH值的逐步增大，多糖得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當緩沖溶液pH值到達7時，多糖得率最大。這是因為不同pH值下多糖中一些特定基團的溶解程度不同[17]，因此，選擇pH 7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為提取溶劑。

2.1.2 微波功率影響

選定料液比 1∶30（g/mL），緩沖溶液的 pH 7，設定超聲功率350 W，提取溫度60℃繼續(xù)超聲輔助提取15 min后，考察不同微波功率微波處理1 min后對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖2。

陽荷多糖得率伴隨微波功率的增加呈現(xiàn)先增后減趨勢，當微波功率達到200 W時陽荷多糖得率達到最大，由于多糖得率會隨著微波功率的增強而出現(xiàn)氧化分解，之后陽荷多糖得率隨著提取功率的增加而逐漸減小，故選擇提取微波功率200 W為宜。

2.1.3 微波時間影響

選定料液比 1∶30（g/mL），緩沖溶液 pH 7，設定超聲功率350 W，提取溫度60℃繼續(xù)超聲輔助提取15 min后，微波功率200 W條件下，考察不同微波處理時間對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖3。

圖2 微波功率對多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the polysaccharide extraction rate

圖3 微波時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave time on the polysaccharide extraction rate

由圖3可知，陽荷多糖得率隨提取時間的增加，呈現(xiàn)先增后減趨勢，在3 min時陽荷多糖的得率達到最大，多糖的浸出率達到了動態(tài)平衡，超過3 min后，多糖氧化分解速度逐漸增加，隨時間的增加陽荷多糖得率逐漸下降。固定微波處理時間為3 min作為進一步優(yōu)化提取的條件。

2.1.4 超聲功率影響

選定料液比 1∶30（g/mL），緩沖溶液的 pH 7，設定微波功率200 W條件下微波時間1 min，繼續(xù)60℃條件下超聲輔助提取15 min，探索不同的超聲功率對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖4。

由圖4可知，陽荷多糖得率隨超聲功率的增大先增加后減小，這是由于超聲波可以加快水的振動，使傳質(zhì)強化，同時加大細胞的破碎程度，可以促進多糖的浸出，但多糖結(jié)構(gòu)也會因為較大的超聲功率而受到一定的破壞出現(xiàn)損失[18]，所以選擇420 W的功率提取陽荷多糖較為適宜。

2.1.5 提取溫度影響

選定料液比 1∶30（g/mL），緩沖溶液的 pH 7，設定微波功率200 W條件下微波時間1 min，超聲功率350 W條件下超聲輔助提取15 min，探索不同的提取溫度對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖5。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the polysaccharide extraction rate

圖5 提取溫度對多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the polysaccharide extraction rate

由圖5可知，陽荷多糖得率隨提取溫度的升高出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在60℃溫度時，陽荷多糖得率達到最大值，而后隨溫度的升高而逐漸下降。因為陽荷多糖結(jié)構(gòu)受到過高的溫度而遭受破壞，部分陽荷多糖被分解，因此，提取陽荷多糖時溫度選擇60℃。

2.1.6 提取時間影響

選定料液比1∶30（g/mL），緩沖溶液的 pH 7，設定微波功率200 W條件下微波時間1 min，超聲功率350 W條件提取溫度為60℃，探索不同的超聲輔助提取時間對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖6。

隨著超聲輔助提取時間的增加，陽荷多糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當超聲處理時間為15 min時陽荷多糖得率達到最大值。當提取時間繼續(xù)增加時，陽荷多糖的分子結(jié)構(gòu)會因為溶液過熱而受到破壞，導致陽荷多糖得率下降。因此超聲輔助提取時間應選擇15 min。

2.1.7 料液比影響

圖6 提取時間對多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the polysaccharide extraction rate

選定緩沖溶液的pH 7，設定微波功率200 W條件下微波時間1 min，超聲功率350 W，提取溫度60℃條件提取15 min，探索不同的料液比對陽荷多糖得率的影響，試驗結(jié)果見圖7。

圖7 料液比對多糖得率的影響Fig.7 Effect of solid to liquid on the polysaccharide extraction rate

由圖7可知，陽荷多糖得率隨溶劑體積增大逐漸增大當達到最大值后緩慢降低，料液比為1∶40（g/mL）時陽荷多糖得率達到最大值，此時多糖的溶出率已達到平衡，繼續(xù)加入提取劑已不能夠再產(chǎn)生更多的陽荷多糖，反而如果繼續(xù)加入過多的提取劑則有可能會造成多糖的損失。因此最佳的料液比為1∶40（g/mL）。

2.2 響應面試驗優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應面分析試驗方案及試驗結(jié)果

固定pH 7檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為提取溶劑，微波功率200 W，微波時間3 min條件下，依據(jù)Box-Benhnken中心組合設計原理[19]，選擇A超聲功率（W）、B提取時間（min）、C提取溫度（℃）、D 料液比（g/mL）4個因素，設計四因素三水平共計27個試驗點，響應面分析試驗方案與結(jié)果見表2。

2.2.2 響應面試驗結(jié)果分析與回歸模型方差擬合

使用Design-Expert7.0軟件，對響應面試驗數(shù)據(jù)進行解析，回歸分析得到結(jié)果見表3。

經(jīng)二次回歸擬合得到多糖得率與超聲功率、提取溫度、提取時間、液料比的函數(shù)表達式即回歸方程為：

表2 響應面分析試驗的設計及結(jié)果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

表3 響應面的方差分析結(jié)果Table 3 The result of variance analysis regression for surface analysis

多糖得率/%=4.76+0.018A+2.778×10-3B+0.044C+0.13D+0.054AB-0.011AC+0.040AD+0.012BC-0.029BD+0.016CD-0.22A2-0.41B2-0.21C2-0.21D2

該回歸模型，F(xiàn) 值 73.82，P＜0.000 1，表明該試驗所得的四元二次回歸方程達到極顯著水平，相關(guān)系數(shù)R2=0.978 8，說明四元二次回歸方程預測值與試驗值具有較高的相關(guān)性，超過97.88%的試驗值可以利用該模型進行解釋與預測。校正后的相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.965 5，表明影響陽荷多糖得率的變化量有96.55%來自于所選變量。失擬項 F=3.30，（P=0.072 1＞0.05），失擬項差異不顯著，說明該試驗誤差較小，殘差由隨機誤差引起。變異系數(shù)（C.V.%=2.13%小于5%），表明該回歸方程擁有較好的重現(xiàn)性。由F及P值分析各因素交互性作用，可以看出BD、AB、AC、BC即提取時間和料液比、超聲功率與提取時間、超聲功率與提取溫度、提取時間與提取溫度的交互作用顯著，其他因素之間的交互作用顯著性相對較弱[20]。由F值分析各因素對陽荷多糖得率的影響強弱順序為料液比＞提取溫度＞超聲功率＞提取時間。綜上分析，所建模型準確性和可信度高，可用于陽荷多糖的提取分析、預測。

2.2.3 最佳工藝條件及驗證性試驗

求解回歸方程，得到陽荷多糖提取的最佳工藝條件為：超聲功率454.30 W，提取溫度為67.20℃，提取時間為15 min，料液比為1∶26.40（g/mL）。預測陽荷多糖的得率10.36%。為了方便實際試驗操作，將理論條件進行近似處理，選擇超聲功率為454 W，超聲輔助提取時間為 15min，提取溫度為67℃，料液比為 1∶26（g/mL），在此工藝條件下，進行3次平行試驗，得到的結(jié)果分別為10.31%、10.39%、10.41%，其平均值為10.40%。該值與理論預測值相比較，相對誤差為0.35%，在試驗允許誤差范圍內(nèi)，說明響應面分析法優(yōu)化陽荷多糖提取試驗結(jié)果可靠，且該工藝具有穩(wěn)定性和可行性。

2.3 陽荷多糖抗氧化性分析

2.3.1 陽荷多糖對DPPH·清除能力

圖8是不同質(zhì)量濃度陽荷多糖和VC清除DPPH·的活性對比圖。

圖8 DPPH·清除能力Fig.8 The elimination ability on DPPH·

由圖8可知，在質(zhì)量濃度為0.02mg/mL～0.39mg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH·清除率變化不明顯，維持在96.00%左右。但陽荷多糖提取液對DPPH·的清除率隨著濃度的變化逐漸升高。在濃度達到0.39 mg/mL時，陽荷多糖提取液對DPPH·清除率為90.2%，清除性能接近VC溶液。這表明陽荷多糖具有較強的DPPH·清除能力。

2.3.2 陽荷多糖對ABTS+自由基清除能力

不同質(zhì)量濃度的陽荷多糖對ABTS+自由基清除活性如圖9所示。

圖9 ABTS+自由基清除能力Fig.9 The elimination ability on ABTS+·

隨陽荷多糖質(zhì)量濃度的增加，其清除ABTS+自由基活性逐漸增強，但同濃度的VC溶液清除ABTS+自由基活性變化緩慢，穩(wěn)定在95.0%～98.0%之間。當陽荷多糖質(zhì)量濃度提高到0.034 mg/mL時，其清除率達到97.6%，但低于VC溶液的清除活性。試驗證明陽荷多糖具有一定的ABTS+自由基清除作用。

2.3.3 陽荷多糖對O2-·清除能力

不同質(zhì)量濃度的陽荷多糖和VC溶液對O2-·清除活性如圖10所示。

圖10 O2-·清除能力Fig.10 The elimination ability on O2-·

較低濃度的陽荷多糖對O2-·清除活性相對較弱；伴隨樣品濃度的增加，陽荷多糖和VC溶液對O2-·清除活性逐漸升高；當VC溶液濃度超過0.18 mg/mL后，其清除效率增強緩慢。當質(zhì)量濃度為0.54 mg/mL時，陽荷多糖對O2-·清除率為85.6%，低于同濃度VC溶液對O2-·清除率99.8%。但能夠說明陽荷多糖在濃度較高時對O2-·清除效果良好，且具有良好的量效關(guān)系。

2.3.4 陽荷多糖對·OH清除能力

圖11為不同質(zhì)量濃度的陽荷多糖和VC溶液對·OH清除能力。

圖11 ·OH清除能力Fig.11 The elimination ability on·OH

對·OH清除活性隨陽荷多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強，較低濃度的陽荷多糖清除能力較弱；當濃度增大到0.54 mg/mL時，陽荷多糖對·OH清除率為89.6%，而VC溶液對·OH清除能力接近100%。體外抗氧化試驗證明陽荷多糖具有一定的清除·OH能力。

3 結(jié)論

以陜南野生陽荷為原材料，多糖得率為評價指標，選取微波-超聲協(xié)同輔助提取法提取陽荷多糖。在單因素試驗的基礎上，結(jié)合響應面分析法優(yōu)化多糖提取工藝，得到結(jié)論如下：

陽荷多糖的最佳提取工藝為：超聲功率454 W，提取時間 15 min，提取溫度 67℃，料液比 1∶26（g/mL），在此工藝條件下，多糖的得率為（10.40±0.35）%。

體外抗氧化試驗表明，陽荷多糖具有較強的清除DPPH·、ABTS+·、O2-·和·OH 能力，其自由基清除活性隨陽荷多糖濃度的增加而增強。在濃度達到0.39 mg/mL時，陽荷多糖提取液對DPPH·清除率為90.2%；當陽荷多糖質(zhì)量濃度為0.034 mg/mL時，陽荷多糖提取液對ABTS+自由基清除率為97.6%；當質(zhì)量濃度增大到0.54 mg/mL時，陽荷多糖對O2-·和·OH清除率分別為85.6%和89.6%，證明陽荷多糖與VC近似具有一定的抗氧化活性，可為其天然抗氧化劑和功能性天然食品的開發(fā)與應用等提供試驗依據(jù)。