黃芩苷對(duì)大鼠壓瘡模型的干預(yù)作用及機(jī)制

安輝，應(yīng)秀東，方晶，梁春光

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

壓瘡(pressure ulcer，PU)是由于機(jī)體突出部位組織受到持續(xù)性壓力導(dǎo)致局部組織長(zhǎng)期持續(xù)血流障礙，致使組織發(fā)生缺血、缺氧性潰爛壞死，現(xiàn)已成為長(zhǎng)期臥床或癱瘓患者常見(jiàn)并發(fā)癥[1]。壓瘡一旦發(fā)生，病程常遷延，并伴多種并發(fā)癥出現(xiàn)，甚至引發(fā)嚴(yán)重的繼發(fā)感染而導(dǎo)致患者死亡[2]。目前，壓瘡的臨床治療多采用西醫(yī)的局部換藥法，效果不理想，特別對(duì)于重癥壓瘡患者，單純換西藥對(duì)創(chuàng)面的愈合效果不佳。促進(jìn)創(chuàng)面局部血管重建及粘膜再生，改善創(chuàng)面微循環(huán)，提高抗感染能力是壓瘡治療的重要因素。

研究表明多酚具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗微生物、抗氧化和抗癌等多種生物學(xué)活性，尤其在預(yù)防和治療炎癥性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。多酚來(lái)源于植物，有8000多種，以糖苷酯或游離糖苷的形式存在[4]。中藥成分黃芩苷屬于多酚家族中的一員，是從黃芩干燥根中提取出來(lái)的黃酮類活性成分，具有抗炎，抗氧化和抗過(guò)敏特性[5]。黃芩苷在體外和體內(nèi)均能抑制Th17細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞之間平衡，可能是治療Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性疾病的治療劑。課題組前期結(jié)果顯示Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與壓瘡損傷過(guò)程[6]，拮抗Th17細(xì)胞的治療方案成為壓瘡治療的新思路。本研究通過(guò)觀察黃芩苷對(duì)壓瘡大鼠模型的干預(yù)效果，進(jìn)一步探討其對(duì)Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠40只、雄性、12～14 w、體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自北京維通利華公司。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，飼料及墊料購(gòu)自北京維通利華公司。

1.2 主要試劑

黃芩苷(純度> 98%)購(gòu)自北京生物制品研究所(批號(hào)201811126)；貝復(fù)濟(jì)購(gòu)自珠海億勝生物制藥有限公司(批號(hào)20180427)HE染色試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號(hào)20190128)；RNA提取及SYBRRT-PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(Cat No 52904)；RORγt、Foxp3、IL-17及β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(Cat No ab11177，ab215206，ab79056，ab8226)；FITC-CD4、Percp-IL-17、Percp-CD25及BV421-Foxp3購(gòu)自美國(guó)BD公司(Cat No 340043、565866、551071、562996)；細(xì)胞破膜劑/緩沖液購(gòu)自美國(guó)BD公司(Cat No 554715)：Brefeldin A購(gòu)自美國(guó)BD公司(Cat No 555029)。TUNEL試劑盒、蛋白marker、loading buffer、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)20180216、20190308、20181229、20190425、20180923)；圓形金屬磁盤(直徑25 mm，厚3 mm)、圓環(huán)形鐵盤(內(nèi)徑8 mm，外徑25 mm，厚1 mm)由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研中心提供。

1.3 建立大鼠壓瘡模型

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)將大鼠分為模型對(duì)照組(A組)、黃芩苷預(yù)防性用藥組(B組)、黃芩苷治療性用藥(C組)和陽(yáng)性對(duì)照組(D組)，每組10只。B組于壓瘡造模前給予預(yù)防性給藥，黃芩苷(100 mg/kg)腹腔注射，每天兩次，連續(xù)14 d。造模前4組大鼠禁食8 h，給予10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，沿背部正中線備皮，縱向切口深至筋膜，用鑷子鈍性分離，將圓環(huán)形鐵盤植入大鼠背部皮下組織，縫合筋膜和皮膚層。體外用圓形金屬磁盤吸引體內(nèi)鐵盤產(chǎn)生持續(xù)壓力，使大鼠皮膚局部缺血。缺血2 h后，取下體外磁盤，使血液恢復(fù)灌注30 min，此為1個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，每天做5個(gè)周期，連續(xù)3 d后取出體內(nèi)鐵盤。腹腔給予葡萄糖-鹽水溶液(2.5 h/3 mL)確保體內(nèi)水和電解質(zhì)平衡。模型構(gòu)建成功后，各組壓瘡大鼠給予不同的處理，在處理前均給予生理鹽水清創(chuàng)和碘伏消毒。A組：腹腔注射等體積PBS，每天兩次，連續(xù)14 d；B組：無(wú)需處理；C組：黃芩苷(100 mg/kg)腹腔注射，每天兩次，連續(xù)14 d。D組：創(chuàng)面均勻噴灑貝復(fù)濟(jì)，再以無(wú)菌紗布包扎。4組每天換無(wú)菌紗布1次，并觀察潰瘍面局部愈合情況。連續(xù)治療14 d后取材檢測(cè)指標(biāo)。其中6只大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡：A組在造模后第3、4天因傷口感染死亡3只、B組在造模后第4天死亡2只，C組在造模后第3天死亡1只。

1.4 局部變化

創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死五項(xiàng)分4個(gè)等級(jí)分?jǐn)?shù)。0分：無(wú)變化，用“-”表示；1分：輕度變化，用“+”表示；2分：中度變化，用“++”表示；3分：重度變化，用“+++”表示。

1.5 標(biāo)本采集

大鼠創(chuàng)面處取材，用于HE、TUNEL、組化染色(4%多聚甲醛，4 ℃)、qPCR(-80 ℃)Western blot(-80 ℃)；開(kāi)腹腔取脾臟，放入含預(yù)冷PBS平皿中備用，后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.6 HE染色

大鼠創(chuàng)面皮膚及皮下肌肉分別用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后封片并鏡檢。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片脫蠟至水；修復(fù)：蛋白酶K覆蓋組織，37 ℃ 25 min，洗滌3次，每次5 min；破膜：滴加破膜工作液，常溫20 min，洗滌3次，每次5 min；加試劑TdT和dUTP混合液：按1∶9混合，覆蓋組織，37 ℃ 2 h；BSA封閉；加一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜；加二抗，避光室溫50 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核；封片；ipwin32分析結(jié)果。

1.8 qPCR檢測(cè)EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10mRNA水平

創(chuàng)面組織用Qiagen勻漿器均質(zhì)，4 ℃ 12 000rpm離心15 min，取上清200 μL提取總RNA后進(jìn)行一步法qPCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s；95 ℃ 15 s，50 ℃ 60 s 40個(gè)循環(huán)；72 ℃繪制熔解曲線。2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測(cè)

RORγt和Foxp3蛋白表達(dá)創(chuàng)面組織勻漿后加入裂解液，12 000 rpm離心，BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。加入10 μL樣品，80 V電泳20 min后，調(diào)電壓至110 V，繼續(xù)電泳20～30 min。120 mA 2 h轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h。加一抗稀釋液RORγt(1∶1000)/ Foxp3(1∶1500)/β-actin(1∶2000)，4 ℃搖床過(guò)夜。TBST洗滌，加1∶10 000稀釋的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。電化學(xué)ECL發(fā)光，ImageJ分析條帶。

1.10 FCM檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞

研磨脾臟，用預(yù)冷PBS重懸脾細(xì)胞并用200目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾至離心管中，離心棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，5 min后用10 mL PBS終止，離心棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，分裝于EP管中1毫升/管。加1640培養(yǎng)基1毫升/管，離心后棄上清，每管加1640培養(yǎng)基200 μL，PMA 2 μL和Ionomycin 2 μL，混勻后培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)1 h，加BFA 1微升/管，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，PBS洗滌后離心。Th17細(xì)胞染色：加FITC- CD4 1微升/管，4 ℃ 30 min，PBS洗滌，離心后棄上清，加破膜液100微升/管，4 ℃ 30 min；Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，加Percp-IL-172微升/管，4 ℃ 30 min。Treg細(xì)胞染色：加FITC- CD4和Percp-CD25 1微升/管，4 ℃ 30 min，PBS洗滌，離心后棄上清，加破膜液100微升/管，4 ℃ 30 min；Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，加BV421-Foxp3 2微升/管，4 ℃ 30 min。兩種細(xì)胞染色后均用Perm wash buffer洗滌，離心后棄上清，buffer重懸細(xì)胞，用300目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面情況評(píng)分

對(duì)大鼠創(chuàng)面五種情況評(píng)分進(jìn)行方差分析，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組相比，黃芩苷預(yù)防和治療性用藥組創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死情況有不同程度的好轉(zhuǎn)(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組創(chuàng)面紅腫、水泡、滲出、潰瘍和壞死評(píng)分較比模型對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.2 HE染色結(jié)果

模型對(duì)照組鱗狀上皮層次不清，毛囊數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)模糊，皮下組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；肌纖維排列紊亂且斷裂明顯，肌橫紋不清晰，間質(zhì)變寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。黃芩苷預(yù)防性和治療性用藥組毛囊結(jié)構(gòu)較清晰，皮下組織有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；黃芩苷預(yù)防性用藥組較治療性用藥組肌纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯，有少量肌纖維斷裂。陽(yáng)性對(duì)照組真皮層內(nèi)毛囊數(shù)量多且清晰，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肌纖維緊密排列，橫紋較清晰，見(jiàn)圖1、圖2。

表2 大鼠創(chuàng)面情況評(píng)分

ABCD

ABCD

2.3 TUNEL法檢測(cè)創(chuàng)面細(xì)胞凋亡

與模型對(duì)照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組創(chuàng)面細(xì)胞凋亡熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.01)。且黃芩苷治療性用藥組下降的幅度高于預(yù)防性用藥組，見(jiàn)表3、圖3、圖4。

ABCD

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組

圖3 大鼠壓瘡組織TUNEL染色(200倍)

表3 大鼠壓瘡組織TUNEL熒光強(qiáng)度值

2.4 EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10 mRNA水平

黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組創(chuàng)面組織EGF、VEGF、TGF-β和IL-10 mRNA水平較比模型對(duì)照組有不同程度的升高(P<0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組各因子明顯高于模型對(duì)照組(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組IL-17和IL-6水平有降低趨勢(shì)(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組水平顯著降低(P<0.01)。黃芩苷治療性用藥組各因子變化幅度均高于黃芩苷預(yù)防性用藥組(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖5。

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組；B與A組比較，a代表P<0.01；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.05

表4 創(chuàng)面組織EGF、VEGF、IL-17、IL-6、TGF-β和IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組；B與A組比較，a代表P<0.05，b代表P<0.01；C與A組比較，c代表P<0.01；D組與A組比較，d代表P<0.01；B與C組比較，e代表P<0.05，f代表P<0.01

2.5 RORγt及Foxp3蛋白表達(dá)

與模型對(duì)照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組RORγt蛋白表達(dá)呈降低趨勢(shì)(P<0.05)，陽(yáng)性對(duì)照組顯著降低(P<0.01)。黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥和陽(yáng)性對(duì)照組Foxp3蛋白表達(dá)較比模型對(duì)照組有小幅增加(P>0.05)，見(jiàn)表5、圖6、圖7。

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組

表5 RORγt及Foxp3蛋白相對(duì)表達(dá)

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組；B與A組比較，a代表P<0.05；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.01

2.6 Th17和Treg細(xì)胞比例

與模型對(duì)照組比較，黃芩苷預(yù)防性、治療性用藥組和陽(yáng)性對(duì)照組脾臟Th17細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)(P<0.01)，Treg細(xì)胞比例有小幅上升(P>0.05)，黃芩苷治療性用藥組Th17比例降低幅度高于預(yù)防用藥組(P<0.05)，見(jiàn)表6、圖8、圖9。

表6 大鼠脾臟Th17和Treg細(xì)胞比例

圖8 大鼠脾臟Th17和Treg細(xì)胞流式圖

A：模型對(duì)照組；B：黃芩苷預(yù)防性用藥組；C：黃芩苷治療性用藥組；D：陽(yáng)性對(duì)照組；B與A組比較，a代表P<0.05；C與A組比較，b代表P<0.01；D組與A組比較，c代表P<0.01；B與C組比較，d代表P<0.05

3 討 論

CD4+T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細(xì)胞，初始CD4+T在不同的細(xì)胞因子刺激下分化為輔助性T細(xì)胞1(T helper cells，Th)、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)和輔助性濾泡T細(xì)胞(Follicular T helper cells，Tfh)[7]。CD4+T細(xì)胞各亞群具有不同的免疫學(xué)功能，其中Th17細(xì)胞為“促炎性細(xì)胞”，主要誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，而Treg細(xì)胞為“抑炎細(xì)胞”，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能，主要介導(dǎo)免疫耐受[8]。二者相互拮抗、彼此制約，維持Th17/Treg細(xì)胞亞群平衡有利于機(jī)體處于穩(wěn)定狀態(tài)。一旦失衡會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如自身免疫性疾病、慢性炎性感染、哮喘和惡性腫瘤[9-10]。本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子參與壓瘡損傷，CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，介導(dǎo)炎癥損傷[6]1857-1861。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)觀察黃芩苷對(duì)壓瘡大鼠模型的干預(yù)效果，進(jìn)一步探討其對(duì)Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡的調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩苷預(yù)防性和治療性用藥均能有效改善壓瘡創(chuàng)面滲出、水泡、紅腫和潰瘍等情況，一定程度上修復(fù)毛囊結(jié)構(gòu)，減少皮下組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)肌纖維再生，使肌纖維排列較緊密。給予黃芩苷治療2 w后創(chuàng)面表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平較比模型組明顯增加。EGF和VEGF 是表皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性多功能細(xì)胞因子，促進(jìn)表皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖再生和基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)[11-12]。由此可見(jiàn)，黃芩苷通過(guò)促進(jìn)EGF和VEGF表達(dá)，改善創(chuàng)面微血管環(huán)境，加強(qiáng)表皮、內(nèi)皮細(xì)胞及纖維組織再生，誘導(dǎo)創(chuàng)面愈合。

黃芩苷不同時(shí)間點(diǎn)用藥均能降低壓瘡局部IL-17和IL-6mRNA水平，并提高TGF-β和IL-10水平。IL-6是誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，分化后并產(chǎn)生特異性IL-17，但Th17細(xì)胞可被高濃度TGF-β抑制；高水平TGF-β促進(jìn)Treg分化，并產(chǎn)生抑制因子IL-10[13]。可見(jiàn)，黃芩苷抑制初始CD4+T細(xì)胞向“促炎性細(xì)胞”Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)其向“抑炎細(xì)胞”Treg分化，進(jìn)而減少壓瘡局部的炎癥損傷。為了進(jìn)一步證實(shí)此觀點(diǎn)，對(duì)影響Th17和Treg細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子RORγt及Foxp3進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷降低RORγt蛋白表達(dá)，并同時(shí)小幅增加Foxp3表達(dá)，提示黃芩苷下調(diào)RORγt以抑制Th17細(xì)胞分化，減少炎癥因子IL-6和IL-17的分泌，同時(shí)小幅上調(diào)Foxp3表達(dá)以促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，有利于Th17/Treg恢復(fù)平衡狀態(tài)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芩苷降低大鼠脾臟Th17細(xì)胞比例，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)果，提示Th17/Treg亞群平衡在壓瘡模型中發(fā)揮重要作用，壓瘡引起Th17細(xì)胞介導(dǎo)創(chuàng)面炎癥損傷，抑制Treg細(xì)胞發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，限制Treg對(duì)Th17介導(dǎo)的過(guò)度免疫應(yīng)答。黃芩苷作為多酚類活性介質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例，誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞亞群恢復(fù)平衡。Sun F等[14]報(bào)道黃芩苷能抑制小鼠Th17細(xì)胞分化，減輕小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。黃芩苷可通過(guò)活化芳基烴受體來(lái)調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎[15]。本研究結(jié)果顯示黃芩苷治療性用藥的干預(yù)效果要高于預(yù)防性用藥，提示黃芩苷對(duì)于慢性炎癥性疾病更適合于作為治療性藥物或佐劑而應(yīng)用。

壓瘡模型中適應(yīng)性免疫細(xì)胞CD4+T細(xì)胞傾向向Th17細(xì)胞亞群分化，Th17/Treg細(xì)胞比例失衡，導(dǎo)致壓瘡創(chuàng)面的持續(xù)性炎癥反應(yīng)，而多酚類黃芩苷應(yīng)用后促進(jìn)機(jī)體Th17/Treg細(xì)胞恢復(fù)平衡，控制過(guò)度炎癥損傷，這為臨床壓瘡治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為新型生物制劑的研制提供新思路。