黑曲霉菌球形態(tài)對產(chǎn)酸影響

摘 ? ? ?要：以黑曲霉Co827菌株為試驗菌株，通過不同培養(yǎng)基營養(yǎng)條件下菌球大小的測量統(tǒng)計分析，考察不同營養(yǎng)對菌球大小的影響。同時，以不同大小的菌球進行發(fā)酵培養(yǎng)，考察發(fā)酵轉化率與菌球大小的關系。結果表明：種子罐培養(yǎng)菌球到菌球截面面積2 450～2 550 μm2，總糖120 g·L-1，其碳氮比35，氮磷比3.5為宜。發(fā)酵罐菌球截面面積控制在3 730～3 820 μm2之間時，發(fā)酵轉化率比較理想。當種子罐菌球截面面積偏小或偏大時，可以降低發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比、氮磷比或提高發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比、氮磷比，使菌球大小向目標菌球大小靠近，可以得到理想轉化率。

關 ?鍵 ?詞：黑曲霉;菌球大小;發(fā)酵;碳氮比;氮磷比

中圖分類號：Q81 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）08-1689-05

Abstract： Aspergillus Niger strain Co827 was used as the test strain，and the measurement and statistical analysis of mycorrhizal size under different nutrient conditions in medium were conducted to investigate the effect of different nutrients on mycorrhizal size. At the same time，the relationship between fermentation conversion rate and bacterial pellet size was investigated. The results showed that： the cross section area from mycelial culture to mycelial culture was 2 450～2 550 μm2，the total sugar was 120 g·L-1， the carbon/nitrogen ratio was 35，the nitrogen/phosphorus ratio was 3.5. When the cross section area of the fermentation tank was controlled in the range of 3 730～3 820 μm2，the fermentation conversion rate was ideal. When the cross section area of mycelium in seed tank was small or large， the ratio of carbon to nitrogen and nitrogen to phosphorus in fermentation medium should be reduced or the ratio of carbon to nitrogen and nitrogen to phosphorus in fermentation medium should be increased，so that the size of mycelium can be close to the target size of mycelium， and the ideal conversion rate can be obtained.

Key words： Aspergillus niger; Mycelium size; Fermentation; C/ N ; N/P

檸檬酸，英文名citric acid，化學名稱為2-羥基-均丙三羧酸，與其他羧酸有相似的物理和化學性質。加熱至175 ℃時它會分解產(chǎn)生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種中強酸，可以電離出3個H+，加熱可以分解成多種產(chǎn)物，與酸、堿、甘油等發(fā)生反應。

檸檬酸最初在1784年由C.W.舍勒首先在水果榨汁中加入石灰乳以形成檸檬酸鈣沉淀的方法制取檸檬酸的。1923年美國菲澤公司建造了世界上第一家以黑曲霉淺檸檬酸粉盤發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的工廠。1952年美國邁爾斯試驗室采用深層發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。近年來各廠家又紛紛在設備規(guī)模上進行擴大。檸檬酸已然發(fā)展為世界上用生物化學方法生產(chǎn)的產(chǎn)量最大的有機酸，是以淀粉質為原料，通過微生物發(fā)酵、提取純化等手段而得到的一種有機酸。檸檬酸及鹽類是發(fā)酵行業(yè)的支柱產(chǎn)品之一，在食品工業(yè)、精細化工、洗滌、醫(yī)藥以及動物養(yǎng)殖上具有廣泛用途。

自21世紀以來，檸檬酸產(chǎn)業(yè)的競爭日趨激烈，許多小企業(yè)紛紛退出該領域，這使全球檸檬酸的生產(chǎn)和進出口更加集中。目前，我國檸檬酸產(chǎn)量已達到177萬t·a-1，占全球產(chǎn)量的67%，是檸檬酸主要生產(chǎn)國和出口國。因此，我國的檸檬酸產(chǎn)能對全球檸檬酸市場具有舉足輕重的作用。隨著供給側改革的深入行動，檸檬酸產(chǎn)業(yè)更應以創(chuàng)新驅動核心技術能力提升，把提高供給體系質量作為主攻方向，促進行業(yè)高質量發(fā)展。

黑曲霉，廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，是制醬、釀酒、制醋的主要菌種，也是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶） 、有機酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）的菌種，農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。它可用來測定錳、銅、鉬、鋅等微量元素和作為霉腐試驗菌[1]。

在液體培養(yǎng)體系中，相較于細菌、酵母發(fā)酵過程，由于霉菌其獨特的特性導致發(fā)酵培養(yǎng)過程中傳質和傳氧兩大關鍵需求與菌體生長特性相背。黑曲霉需氧（dissolved oxygen）和傳質（mass transfer）需要大攪拌轉速，黑曲霉菌球生長過大則菌球內部缺氧、傳質差;菌球過散或不成為菌球，則松散菌球或菌絲容易在攪拌的剪切力下破碎或斷裂，都會影響黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酸。

1.4.4 ?菌球測量

取培養(yǎng)液加水稀釋10倍，然后將稀釋液1滴與載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡上放大300倍，利用在線拍照軟件中的測量功能，對視野里的菌球進行測量，測量分為兩種：取兩點測菌球直徑和取三點為圓測菌球面積。菌球大小的數(shù)據(jù)取視野內所有菌球直徑（面積）的平均值為該種子罐或發(fā)酵罐的菌球直徑（面積）。本文中主要以鏡頭下菌球面積為分析點。

2 ?數(shù)據(jù)與分析

2.1 ?不同營養(yǎng)對菌球大小的影響

表3為種子罐正交搖瓶方差分析結果。在表3的菌球截面積方差分析結果中顯示：碳氮比和氮磷比的極差值3.57和2.26遠大于1.30，而糖濃度的極差值0.86小于1.30。因此，氮源和磷源含量對種子罐菌球的菌球截面積大小的影響很大。糖濃度對菌球截面積大小的影響較小。

同時，也通過比較分析得出：氮源含量越高菌球截面積越大，即菌球越大;磷源含量升高，對菌球截面積的影響次之。在一定范圍內的糖濃度對菌球截面積大小的影響很小[5]。

根據(jù)上面得出的結論，以碳氮比為主要考察因素設計出的總糖11%、碳氮比（25、30、35、40）、氮磷比（3.2、3.5）為配方在5 L小罐上驗證。得出菌球面積數(shù)據(jù)如表4。

圖3再次驗證了菌球的大小與碳氮比的關系密切，隨著碳氮比的升高而減小，與氮磷比有相關，隨著氮磷比的降低而增大，但氮磷比的影響沒有碳氮比明顯。

2.2 ?菌球大小對發(fā)酵結果的影響

2.2.1 ?菌球大小對轉化率的影響

按照正交搖瓶配方培養(yǎng)的菌球液接入相同發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)72 h的搖瓶菌球大小及產(chǎn)酸結果如圖4。

從圖4可以看出，搖瓶轉速提高50 r·min-1對菌球大小沒有改變，400 r·min-1和450 r·min-1搖瓶菌球大小和趨勢基本一致。當搖瓶轉速在400 r·min-1時，菌球面積在3 716 μm2和3 776 μm2時轉化率達到了頂峰值。大于或小于該面積的轉化率都偏低。當提高搖瓶轉速至450 r·min-1時，對菌球面積小的沒有影響，菌球面積大的，其轉化率會有所提高，菌球面積3 941 μm2的轉化率由92.46%提高到95.53%。

這是由于對小菌球而言，400 r·min-1的搖瓶轉速已經(jīng)足夠其供氧和傳質的需求了，再提高轉速對其影響不大。然后，對于菌球偏大的，由于菌球直徑增大，氧、營養(yǎng)等物料運輸就要克服更大的阻力，因此提高轉速對于大菌球有一定效果，但隨著菌球的增大，其效果降低。

2.2.2 ?改變培養(yǎng)基營養(yǎng)對菌球大小和轉化率的影響

按照1.4.3進行搖瓶發(fā)酵的結果如圖5所示。

經(jīng)過營養(yǎng)調整后，給予小面積的菌球以更加豐富的營養(yǎng)，給予大面積菌球以貧瘠一些的營養(yǎng)，經(jīng)過發(fā)酵結束時的菌球大小測量發(fā)現(xiàn)，給予一定的營養(yǎng)后，菌球有不同程度的增大，營養(yǎng)豐富的菌球增大越加明顯，經(jīng)過調整以后，各搖瓶菌球面積之間的差距變小了。

同時，經(jīng)過調整后，因菌球面積的變化，搖瓶轉化率也發(fā)生了變化。小菌球因營養(yǎng)豐富增大后轉化率也提高了，大菌球因營養(yǎng)減少也變得沒有原來那么大了，轉化率也提升了。

4組、8組、11組、12組、14組和15組這6組搖瓶得各自平均轉化率均都在95%以上，4組、8組菌球增大，14組和15組菌球減小，調整后其菌球在3 730～3 820 μm2之間。其余10組菌球面積或大于3 820 μm2或小于3 720 μm2，其轉化率均低于95%。

3 ?結果與討論

3.1 ?營養(yǎng)對菌球大小的影響

對于黑曲霉檸檬酸發(fā)酵來說，菌球大小影響傳氧和傳質，而在供氧充足的情況影響菌球大小的主要因素為培養(yǎng)基的營養(yǎng)，而通過本實驗說明，碳氮比是影響菌球大小的最顯著因素，其次為氮磷比。營養(yǎng)過于豐富，則菌球增長過大，導致菌球內部氧氣的供給和物料的傳輸困難。合適的碳氮比和氮磷比可以使菌球生長到合適的大小。

3.2 ?菌球大小對發(fā)酵轉化率的影響

菌球大小一方面影響菌球本身的生長需要消耗碳源。另一方面，當菌球數(shù)量一定時，菌球過小時，菌體生物量低，產(chǎn)物合成速率慢，導致發(fā)酵周期延長;當菌球過大時，導致菌球內部供氧不足，在供氧不足的情況下，側系呼吸鏈不同程度的失活，呼吸鏈發(fā)生偏轉到常規(guī)呼吸鏈，常規(guī)呼吸鏈大量消耗碳源產(chǎn)生大量ATP抑制糖酵解途徑通量使轉化率大幅下降。菌球小是因為生物量不夠，殘?zhí)歉撸D化率低;菌球過大是因為菌球生長和菌球內部供氧不足，導致大量產(chǎn)生能量消耗的碳源過多而轉化率低。當菌球偏大時，提高供氧，在一定程度上可以提高發(fā)酵轉化率。

4 ?結 論

本文主要研究了菌球大小與發(fā)酵轉化率的關系，同時也研究了菌球大小與培養(yǎng)基之間的營養(yǎng)比例的關系。為了達到高速產(chǎn)酸和高收率，種子罐培養(yǎng)菌球到菌球截面面積2 450～2 550 μm2，總糖120 g·L-1，其碳氮比35，氮磷比3.5為宜。發(fā)酵罐菌球截面面積控制在3 730～3 820 μm2之間時，發(fā)酵轉化率比較理想。在種子培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，需要根據(jù)實際情況從多個角度采用動態(tài)理念進行調整[6]。當種子罐菌球截面面積偏小或偏大時，可以降低發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比、氮磷比或提高發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比、氮磷比，使菌球大小向理想菌球大小靠近。

參考文獻：

[1]王博彥，金其榮. 發(fā)酵有機酸生產(chǎn)與應用手冊[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2000.

[2]唐文俊，夏建業(yè)，儲炬，等. 黑曲霉發(fā)酵過程中菌體形態(tài)的分析方法建立及應用[J]. 生物工程學報，2015（2）：291-299.

[3]王寶石，李林波，譚鳳玲，等. 剪切力敏感型微生物形態(tài)塑造及其在檸檬酸發(fā)酵中的應用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44（12）：267-273.

[4]盧宗梅，周勇，楊儒文，等. 全清液發(fā)酵營養(yǎng)組學的精準控制[J].當代化工，2019，48（4）：830-833.

[5]張偉心，王建平. 有機氮源對檸檬酸發(fā)酵的影響[J]. 河北大學學報：自然科學版，2000（2）：157-162.

[6]張嗣良，儲炬. 多尺度微生物過程優(yōu)化[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2003.