冬青葉中黃酮類化合物提取方法比較研究

李睿

(西安郵電大學(xué) 經(jīng)濟與管理學(xué)院,陜西 西安 710121)

冬青屬于喬木植物，主要生長分布在長江中下游省份[1]。冬青的根、莖、葉都有藥用功效，其提取物具有抑菌、消炎、促進血液循環(huán)等作用[2]。冬青葉所含化學(xué)成分相對復(fù)雜，包括黃酮類、三萜類、皂苷、氨基酸等成分[3-4]。黃酮類化合物具有多種藥理及生物學(xué)活性，具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤、保護心腦血管系統(tǒng)、提高免疫力等作用[4-5]，合理開發(fā)利用黃酮類化合物有著重要的藥用意義。

本文分別采用水浴提取法[6]、水浴攪拌提取法[7]和微波輔助提取法[8]提取冬青葉中的黃酮類化合物，利用正交實驗優(yōu)化3種方法的提取工藝并做以比較，得出提取冬青葉中黃酮類化合物的最佳工藝。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

冬青葉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、結(jié)晶三氯化鋁均為分析純；蒸餾水。

AL204電子分析天平；FZ102微型植物粉碎機；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋；101-3AB電熱鼓風(fēng)干燥箱；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；752N紫外可見分光光度計；365 nm紫外分析儀。

1.2 實驗方法

將新鮮的冬青葉烘干至恒重，粉碎后過篩，得冬青葉干粉。取10 g冬青葉干粉于燒杯中，分別采用水浴提取法、水浴攪拌提取法和微波輔助提取法按照L9(34)正交設(shè)計對冬青葉中黃酮類化合物進行單次提取，考察其提取率。提取液濃縮后定容至50 mL，采用硝酸鋁比色法測定黃酮類化合物的含量。

1.3 測定方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg(120 ℃干燥2 h)，以70%的乙醇溶解定容至100 mL，搖勻，得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL放入25 mL具塞比色皿中，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，靜置6 min后再加4%的氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，靜置15 min，最后以70%的乙醇溶液定容至25 mL。在波長510 nm處測不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值，得到回歸方程為：A=11.867C-0.017 2,R2= 0.999 8(A為吸光度，C為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/mL)。

1.3.2 黃酮類化合物含量的測定 吸取1 mL濃縮定容后的提取液，加5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min后加10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，靜置6 min后加4%的氫氧化鈉溶液5 mL，靜置15 min后以蒸餾水定容至25 mL。在波長510 nm處測定吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 水浴法提取黃酮的最佳工藝

以溫度、時間、固液比和乙醇濃度為考察因素，采用水浴提取法提取，選擇L9(34)正交設(shè)計實驗，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交L9(34)實驗結(jié)果

由表2可知，使用水浴提取法時，影響提取效果的因素順序為：A>C>D>B，溫度對提取率的影響最大。最優(yōu)化工藝為A2B2C3D2，即提取溫度70 ℃，時間120 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇濃度60%。

2.2 水浴攪拌法提取黃酮的最佳工藝

以溫度、時間、固液比和乙醇濃度為考察因素，采用水浴攪拌提取法提取，選擇L9(34)正交設(shè)計實驗，因素及水平見表3，結(jié)果見表4。

表3 正交實驗因素水平

由表4可知，使用水浴攪拌提取法時，影響提取效果的因素順序為A>C≈D>B，提取溫度對提取率的影響最大。最優(yōu)化工藝為A2B1C3D2，即提取溫度70 ℃，時間60 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇濃度60%。

表4 正交L9(34)實驗結(jié)果

2.3 微波輔助法提取黃酮的最佳工藝

以溫度、時間、固液比和乙醇濃度為考察因素，采用微波輔助提取法提取，選擇L9(34)正交設(shè)計實驗，因素及水平見表5，結(jié)果見表6。

表5 正交實驗因素水平

表6 正交L9(34)實驗結(jié)果

由表6可知，使用微波輔助提取法時，影響提取效果的因素順序為：A>C>B>D，提取溫度對提取率的影響最大。最優(yōu)化工藝為A2B1C1D3，即提取溫度70 ℃，時間20 min，固液比1∶8 g/mL，乙醇濃度70%。

2.4 提取方法比較

根據(jù)以上3組正交L9(34)實驗結(jié)果，采用水浴提取法、水浴攪拌提取法和微波輔助提取法按照其最佳提取條件，分別對冬青葉中黃酮類化合物進行單次提取，每組實驗做3個重復(fù)，取平均值，結(jié)果見表7。

表7 提取方法比較

由表7可知，水浴提取法、水浴攪拌提取法和微波輔助提取法的提取率分別為3.96，4.18，4.92 mg/g。水浴攪拌法提取率高于水浴法是因為攪拌減小了分子間的聚集作用，增加了提取液與顆粒之間的接觸面積，提高了提取率[9]。微波輔助提取法的提取率最高，是因為微波破壞了冬青葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞中有效成分快速釋放到提取液中，提高了提取率，并且大大縮短了提取時間[10]。

3 結(jié)論

(1)水浴提取法、水浴攪拌提取法和微波輔助提取法提取冬青葉中黃酮類化合物的最佳工藝為：①水浴提取法：提取溫度70 ℃，時間120 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇濃度60%；②水浴攪拌提取法：提取溫度70 ℃，時間60 min，固液比1∶12 g/mL，乙醇濃度60%；③微波輔助提取法：提取溫度70 ℃，時間20 min，固液比1∶8 g/mL，乙醇濃度70%。3種提取方法的最佳工藝條件下的提取率為3.96，4.18，4.92 mg/g。

(2)微波輔助提取法提取率最高，大大縮短了提取時間，但是對實驗設(shè)備要求較高，水浴攪拌提取法相比水浴提取法提取率提高幅度不大，且水浴提取法操作簡便、節(jié)約成本，適合工業(yè)化大批量生產(chǎn)。