初治慢性HBV感染者血清標(biāo)志物定量與血常規(guī)、肝功能及病毒載量相關(guān)性分析

唐亞芳 閻雙緩 王曉靜 陳勇良 戴二黑 李敏然

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個(gè)全球性的重大健康問題[1]。目前全世界范圍內(nèi)曾有約20億人感染HBV，其中2.5億人為慢性感染。而中國(guó)慢性HBV感染者約有7800萬，每年死于HBV相關(guān)肝硬化、肝癌人數(shù)達(dá)30萬[2,3]。HBV是一類嗜肝部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒，HBV感染人體進(jìn)入肝細(xì)胞后，部分雙鏈環(huán)DNA在細(xì)胞核內(nèi)延長(zhǎng)正鏈后成為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。cccDNA是原始復(fù)制模板，用多種啟動(dòng)子能轉(zhuǎn)錄出多種mRNA，其中2.1 kb、2.4 kb的mRNA編碼合成外膜大、中、主蛋白(hepatitis B surface antigen，HBsAg)，3.5 kb的前基因組(pg)RNA編碼合成P蛋白、C蛋白(hepatitis B core antigen，HBcAg)和前C蛋白。前C蛋白經(jīng)切割處理形成乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)。以pgRNA為模板反轉(zhuǎn)錄HBV DNA，然后組裝各種HBV蛋白而成為完整的病毒顆粒，成熟的毒粒向細(xì)胞外分泌。因而，HBV感染人體后，外周血會(huì)出現(xiàn)大量的病毒顆粒。既往通過ELISA定性法可以檢測(cè)HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb即乙肝五項(xiàng)血清標(biāo)志物，以判斷患者是否感染HBV及感染狀態(tài)。近年來HBV血清標(biāo)志物定量檢測(cè)方法相繼出現(xiàn)并在臨床迅速推廣應(yīng)用[4]，因此本文將探索HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、HBcAb)定量檢測(cè)與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性，分析其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中的717例研究對(duì)象均為2012年1月至2018年3月在石家莊市第五醫(yī)院門診及住院就診的慢性HBV感染者，其中男483例，女234例；年齡12～74歲，平均年齡(33.26±11.53)歲；病程1～32年，平均病程(15.34±8.02)年。所有患者符合我國(guó)2019年版慢性乙型肝炎防治指南[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①HBsAg陽(yáng)性至少6個(gè)月；②既往未接受保肝、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)劑等治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲、丙、戊等其他嗜肝病毒感染；②人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus,HIV)感染者；③合并藥物、酒精、中毒及其他因素引起的肝功能異常；④肝硬化或原發(fā)性肝癌；⑤妊娠、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病、癲癇等；⑥應(yīng)用激素等免疫抑制劑治療；⑦惡性腫瘤患者。

1.3 檢測(cè)方法 受檢者均在清晨空腹時(shí)經(jīng)肘靜脈采血，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(XN-1000，日本SYSMEX公司)檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HB)、血小板(PLT)。使用全自動(dòng)酶免分析生化儀(Hitachi 7600，日本HITACHI公司)檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)生化學(xué)指標(biāo)，ALT的正常上限值(upper normal limit,UNL)為40 U/L。血清HBV DNA定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)，檢測(cè)儀器采用美國(guó)ABI公司ABI7300型PCR儀，試劑配套試劑，最低檢測(cè)下限為500 U/ml。HBV血清學(xué)標(biāo)志(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb)檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測(cè)定方法，儀器為美國(guó)羅氏公司生產(chǎn)全自動(dòng)免疫分析儀e601，試劑為配套試劑，HBsAg定量檢測(cè)范圍為0.05～130 000 U/ml。HBcAb定量檢測(cè)采用鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的HBcAb定量試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 717例初治慢性HBV感染者中，560例為HBeAg陽(yáng)性感染者，157例為HBeAg陰性感染者。HBeAg陽(yáng)性組患者年齡、病程顯著低于HBeAg陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBeAg陽(yáng)性組患者血小板計(jì)數(shù)、HBV DNA水平及HBsAg滴度顯著高于HBeAg陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但HBeAg陽(yáng)性組患者TBIL與HBcAb定量水平顯著低于HBeAg陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 初治HBV慢性感染者臨床基本特征

2.2 HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量與其他指標(biāo)相關(guān)性 HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與性別無相關(guān)性，與年齡、PLT、ALT、AST、TBIL及HBcAb(r=-0.16，P<0.001)呈弱相關(guān)，僅與HBV DNA呈中等相關(guān)。HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBcAb水平與年齡、性別無相關(guān)性，與PLT、TBIL、HBV DNA呈弱相關(guān)，與ALT、AST呈中等相關(guān)。見表2。

表2 HBeAg陽(yáng)性初治HBV慢性感染者血清標(biāo)志物定量與其他指標(biāo)相關(guān)性

2.3 HBeAg陰性慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量與其他指標(biāo)相關(guān)性 HBeAg陰性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBcAb(r=-0.06，P=0.45)無相關(guān)性，與年齡、性別、PLT、ALT、AST、TBIL及HBV DNA呈弱相關(guān)。HBeAg陰性慢性HBV感染者血清HBcAb水平與性別、TBIL無相關(guān)性，與年齡、PLT、HBV DNA呈弱相關(guān)，與ALT、AST呈中等相關(guān)。見表3。

表3 HBeAg陰性初治HBV慢性感染者血清標(biāo)志物定量與其他指標(biāo)相關(guān)性

2.4 慢性HBV感染者血清HBsAg定量與HBV DNA相關(guān)性分析 HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBV DNA呈正相關(guān)，即HBsAg水平隨著HBV DNA升高而增加(r=0.42，P<0.001)，但HBeAg陰性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBV DNA呈弱相關(guān)(r=0.14，P=0.08)。見圖1。

圖1 初治慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBV DNA相關(guān)性

2.5 慢性HBV感染者血清HBcAb定量與ALT相關(guān)性分析 慢性HBV感染者血清HBcAb水平隨著ALT水平升高而逐漸升高。在HBeAg陽(yáng)性者中，血清HBcAb定量與ALT呈中等正相關(guān)(r=0.36，P<0.001)，當(dāng)ALT>120 U/L后，HBcAb水平不再顯著升高；在HBeAg陰性者中，血清HBcAb定量與ALT亦呈中等正相關(guān)(r=0.37，P<0.001)，120 U/L0.05)。見表4，圖2。

表4 初治HBV慢性感染者血清HBcAb定量與ALT相關(guān)性

HBeAg 陽(yáng)性者 HBeAg 陰性者圖2 初治慢性HBV感染者血清HBcAb水平與ALT相關(guān)性

3 討論

我國(guó)目前慢性HBV感染者多為圍生期或嬰幼兒時(shí)期感染。圍生期或嬰幼兒時(shí)期感染HBV后，其慢性HBV感染的自然史根據(jù)自然病程一般可劃分為4個(gè)期，即免疫耐受期(慢性HBV攜帶狀態(tài))、免疫清除期(HBeAg陽(yáng)性CHB)、免疫控制期(非活動(dòng)HBsAg攜帶狀態(tài))和再活動(dòng)期(HBeAg陰性CHB)[5]。免疫耐受期患者：HBeAg陽(yáng)性、HBV DNA高于2×107U/ml、ALT正常，肝臟無明顯炎癥壞死和纖維化；免疫清除期：HBeAg陽(yáng)性、HBV DNA高于2×104U/ml、ALT持續(xù)或反復(fù)升高，肝臟有明顯炎癥壞死和(或)纖維化；免疫控制期：HBeAg陰性、HBV DNA低于2×103U/ml、ALT正常，肝臟無或僅有輕度炎癥，可有不同程度纖維化；再活動(dòng)期：HBeAg陰性、HBV DNA高于2×103U/ml、ALT持續(xù)或反復(fù)升高，肝臟有明顯炎癥壞死和(或)纖維化。

慢性HBV感染者可進(jìn)展至肝硬化、肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明，未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B，CHB)在確診之后，進(jìn)展為肝炎肝硬化的5年累積發(fā)病率為8%～20%；未經(jīng)治療的代償期肝炎肝硬化患者進(jìn)展為失代償期肝炎肝硬化的5年累積發(fā)病率約為20%；而未經(jīng)治療的失代償期肝炎肝硬化患者預(yù)后極差，5年累積生存率只有14%～35%[6-8]。目前用于治療CHB的抗病毒藥物有干擾素和核苷(酸)類似物。有證據(jù)表明，長(zhǎng)期有效的抗病毒治療可以改善預(yù)后，延緩疾病進(jìn)展，減少肝炎肝硬化、原發(fā)性肝癌的發(fā)生[6-10]。目前我國(guó)指南建議2019年版慢性乙型肝炎防治指南建議HBV DNA陽(yáng)性的慢性HBV感染者，若其ALT持續(xù)異常且排除其他原因?qū)е碌腁LT升高，均應(yīng)考慮開始抗病毒治療，即包括免疫清除期、再活動(dòng)期患者。隨著HBV血清標(biāo)志物定量檢測(cè)技術(shù)的開展，越來越多的研究顯示HBV血清標(biāo)志物定量水平可協(xié)助判斷疾病進(jìn)程、評(píng)估疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)測(cè)治療效果等[9,10]。

HBsAg是HBV的外膜蛋白，是HBV感染的標(biāo)志，在HBV感染者血液中以三種形式的顆粒存在：Dane顆粒、小球顆粒和管形顆粒，Dane顆粒內(nèi)含部分雙鏈環(huán)狀DNA，是病毒復(fù)制的主體，后兩者是空心顆粒，無感染性，但數(shù)目大量超過感染性Dane顆粒[11,12]。血清HBsAg是由具有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA及整合到肝細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA翻譯產(chǎn)生，因此，我國(guó)2019年版慢性乙型肝炎防治指南建議慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者抗病毒治療過程中HBsAg陰轉(zhuǎn)后可考慮停止治療，HBsAg陰轉(zhuǎn)視為CHB患者功能性治愈的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBsAg定量水平與HBV DNA呈正相關(guān)，但HBeAg陰性者血清HBsAg定量水平與HBV DNA無顯著相關(guān)性。一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)HBeAg陽(yáng)性黑猩猩肝組織中病毒mRNA主要來源于cccDNA，而HBeAg陰性黑猩猩肝內(nèi)90%以上病毒mRNA來自整合的HBV DNA，僅10%來自HBV cccDNA[13]。這可能是HBeAg陰性CHB患者血清HBsAg水平與HBV NDA缺乏相關(guān)性的主要原因之一。另有研究顯示在慢性HBV感染自然史中，HBsAg定量在免疫耐受期最高，免疫清除期、免疫控制期逐漸下降，而再活動(dòng)期會(huì)高于免疫控制期，與HBV DNA定量變化趨勢(shì)一致[14]。Brunetto等[15]研究結(jié)果顯示當(dāng)慢性HBV感染者血清HBsAg<1 000 U/ml且HBV DNA<2 000 U/ml，預(yù)測(cè)免疫控制期患者診斷準(zhǔn)確率達(dá)93.8%。CHB患者抗病毒治療HBV DNA低于可檢測(cè)值下限值后，多數(shù)患者HBsAg定量水平逐漸緩慢下降，少部分患者HBsAg無下降趨勢(shì)[16]，究其原因亦可能與整合的HBV DNA相關(guān)。因此，應(yīng)用核苷酸類似物或長(zhǎng)效干擾素抗病毒過程中，治療基線及初始階段的HBsAg定量水平及下降速度可以預(yù)測(cè)血清學(xué)轉(zhuǎn)換，包括HBeAg、HBsAg[17-19]。

HBcAg是病毒結(jié)構(gòu)蛋白，參與HBV復(fù)制，同時(shí)具有極強(qiáng)的免疫原性，能夠直接激活機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生特異性HBcAb，極大多數(shù)感染者都產(chǎn)生HBcAb。由于HBcAb在細(xì)胞核內(nèi)，外周血只能檢測(cè)到HBcAb。HBV不直接損傷肝細(xì)胞，肝細(xì)胞病變主要是免疫應(yīng)答反應(yīng)引起的，機(jī)體的免疫應(yīng)答在HBV感染的清除和致病機(jī)制中起至關(guān)重要的作用。機(jī)體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)識(shí)別感染HBV肝細(xì)胞表面的靶抗原后，經(jīng)穿孔素途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞壞死，破壞感染肝細(xì)胞同時(shí)清除病毒，細(xì)胞壞死肝細(xì)胞受損后會(huì)釋放胞內(nèi)ALT。本研究結(jié)果顯示，慢性HBV感染者血清HBcAb定量水平與ALT呈正相關(guān)，隨著ALT水平升高，HBcAb水平亦升高。但當(dāng)ALT升高到一定程度后，HBcAb定量達(dá)到平臺(tái)，不再隨之升高。該結(jié)果提示，機(jī)體針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答機(jī)制頗為精細(xì)、復(fù)雜，當(dāng)免疫應(yīng)答過強(qiáng)后，免疫負(fù)調(diào)控有可能會(huì)發(fā)生作用。HBcAb與HBsAg產(chǎn)生機(jī)制不同，因此在慢性HBV感染中的自然史中變化趨勢(shì)不同。HBcAb定量在免疫耐受期與免疫控制期顯著低于免疫清除期與再活動(dòng)期，同樣，與ALT水平相關(guān)[20]。因機(jī)體免疫應(yīng)答在HBV清除中起主導(dǎo)地位，應(yīng)用長(zhǎng)效干擾素抗病毒過程中，治療基線及初始階段的HBcAb定量水平及下降速度同樣可以預(yù)測(cè)HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[21,22]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示初治HBeAg陽(yáng)性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBV DNA呈正相關(guān)，HBeAg陰性慢性HBV感染者血清HBsAg水平與HBV DNA相關(guān)性則弱，而HBeAg陽(yáng)性與陰性慢性HBV感染者血清HBcAb水平與ALT均呈正相關(guān)，兩者區(qū)別應(yīng)與其生物學(xué)特性相關(guān)。因此在臨床工作中，監(jiān)測(cè)慢性HBV感染者血清HBsAg、HBcAb定量變化可助于判斷病情及指導(dǎo)制定治療方案。