乙烯和水楊酸在大豆胞囊線蟲(chóng)與大豆間親和性反應(yīng)中的相互作用

胡巖峰，尤 佳，潘鳳娟

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

0 引 言

大豆胞囊線蟲(chóng)(HeteroderaglycinesIchinohe,soybean cyst nematode,SCN)病是造成大豆減產(chǎn)最嚴(yán)重的植物病害之一。世界范圍內(nèi)，每年僅因SCN病害造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)十億美元。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SCN在我國(guó)東北、黃淮海等大豆主產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生與分布[1]，并且近年來(lái)逐漸向西北、西南省份蔓延[2-4]，嚴(yán)重制約我國(guó)大豆安全生產(chǎn)。

合理利用抗病基因，選育穩(wěn)定、廣譜及持久的大豆抗病品種是防治SCN病害最經(jīng)濟(jì)有效的手段[5]，而最優(yōu)化的植物病害安全控制途徑是充分發(fā)揮寄主自身的抗病防御機(jī)制。植物抗病性是多個(gè)基因協(xié)同作用的結(jié)果，涉及許多防御信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和次生代謝途徑的變化。目前，對(duì)于寄主大豆與SCN間的互作分子基礎(chǔ)涉及哪些重要的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)尚缺乏準(zhǔn)確、深入和完整的認(rèn)識(shí)。此外，SCN與大豆在長(zhǎng)期互作中形成復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系，導(dǎo)致SCN小種出現(xiàn)遺傳變異的多樣性[6-7]。SCN向寄主根細(xì)胞分泌效應(yīng)蛋白逃避或抑制寄主防御，是大豆對(duì)SCN抗性喪失的一個(gè)主要原因[8]。因而，深入研究大豆應(yīng)對(duì)SCN的防御信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)抗病防治和抗病遺傳育種工作具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

植物激素在精細(xì)調(diào)控植物抗病性的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起著全局性樞紐作用。乙烯(Ethylene,ET)和水楊酸(Salicylic Acid,SA)作為重要的植物生長(zhǎng)激素，在植物抗病蟲(chóng)害防御反應(yīng)中的作用被廣泛報(bào)道[9]。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)，ET和SA途徑也參與調(diào)控寄主植物與植物病原線蟲(chóng)間相互作用[10]，尤其在抵御根結(jié)線蟲(chóng)的防御反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用[11-15]，但ET和SA在植物響應(yīng)胞囊線蟲(chóng)侵染中的功能研究較少。已有研究表明，過(guò)表達(dá)大豆SA甲基轉(zhuǎn)移酶基因GmSAMT能顯著增加大豆對(duì)SCN的抗性[16]。另外，在感病大豆中，異源表達(dá)擬南芥SA途徑的關(guān)鍵基因AtPAD4、AtNPR1、AtTGA2、AtPR-5也能部分提高大豆對(duì)SCN的抗性[17-18]。這些證據(jù)表明，SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是抗SCN防御反應(yīng)中重要組成部分。然而，ET途徑似乎在植物應(yīng)對(duì)胞囊線蟲(chóng)的抗性互作過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。例如，擬南芥的乙烯過(guò)量產(chǎn)生突變體則對(duì)甜菜胞囊線蟲(chóng)(Heteroderaschachtii)變得易感[19-21]，SCN也在大豆乙烯不敏感突變體etr1-1和T124N38根中發(fā)育遲緩，并且雌蟲(chóng)數(shù)減少[22]。此外，SA與ET途徑在許多植物抗病防御反應(yīng)過(guò)程中往往存在協(xié)同或拮抗作用[23]。由于這些研究尚處在初期，SA和ET在大豆與SCN互作反應(yīng)中的具體作用機(jī)理尚不清楚，兩者之間的相互作用關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆(Glycinemax(L.) Merr.)為William 82，由中國(guó)科學(xué)院大豆分子設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大豆種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min后，用自來(lái)水沖洗30 min，置于25 ℃下暗處催芽4天后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)(光照強(qiáng)度95 800 Lux，日照時(shí)間13 h晝/11 h夜，溫度26 ℃晝/22 ℃夜，濕度65%)。SCN5號(hào)生理小種由本實(shí)驗(yàn)室提供，接種在感病大豆品種“東生1”上繁殖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。大豆在光下生長(zhǎng)10天后，每株幼苗接種2 000條J2幼蟲(chóng)，侵染24 h后收集大豆根組織用于RNA提取。制備的RNA樣品送至北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序及后期數(shù)據(jù)分析(包括本研究中MapMan分析)。

1.2.2 乙烯利、水楊酸外源處理。乙烯利(Ethephon，ETH)和SA均購(gòu)自Sigma公司。ETH在無(wú)菌雙重水中溶解后配制成0.1 mM、0.2 mM及0.5 mM處理濃度。SA在乙醇中溶解后用雙重水配制成0.5 mM、1 mM及2 mM處理濃度。如圖1所示，待大豆幼苗第一對(duì)真葉完全展開(kāi)后，用氣壓噴壺噴施葉片并置于暗處處理24 h，噴施無(wú)菌雙重水作為對(duì)照組。

1.2.3 線蟲(chóng)接種。采用改良淘洗-過(guò)篩法從土壤中收集SCN胞囊，經(jīng)蔗糖梯度密度離心分離飽滿(mǎn)胞囊，用組織研磨器破碎胞囊外殼，將收集的卵置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，4天后收集孵化的J2幼蟲(chóng)用于接種。大豆萌發(fā)方法同上，挑選發(fā)芽一致大豆移栽至包含沙土(1∶1)的營(yíng)養(yǎng)缽(直徑7.0 cm×高度11.0 cm)，每缽1株苗。光下生長(zhǎng)10天后，每株幼苗接種400條J2幼蟲(chóng)。接種2天、3天、5天、8天、35天后，收集大豆根系用于RNA提取或線蟲(chóng)檢測(cè)(圖1)。

1.2.4 品紅染色[24]。大豆根系置于15%次氯酸鈉中浸泡10 min，轉(zhuǎn)移至雙重水中清洗約15 min。徹底除去次氯酸鈉后，將根系置于35%酸性品紅(Sigma)煮沸30 s，冷卻至室溫。壓片后在體式解剖鏡下統(tǒng)計(jì)根內(nèi)線蟲(chóng)數(shù)目。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表達(dá)。利用Trizol (Invitrogen)提取大豆根組織總RNA，并經(jīng)DNase I (Invitrogen)37 ℃消化處理45min去除基因組DNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(Thermo Fisher)合成cDNA第一鏈。將cDNA模版添加至AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)混合均勻(反應(yīng)體系20 ul)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀LightCycler?480上擴(kuò)增目標(biāo)基因，反應(yīng)條件參照AceQ?Universal SYBR試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用2-ΔΔCT法分析目標(biāo)基因表達(dá)，內(nèi)參基因?yàn)镚mUbiquitin3[25]。所用的引物序列分別為：GmICS1-F：GGCCATTTCGGAGCTGG；GmICS1-R：AGGAGAAGGTGGTTCTGTGAGAGA；GmICS2-F：CATGGCCAT-TTCGGAGCTTA；GmICS2-R：CAGAAGATGGTTCTGCGAATGG；GmEDS1-F：TGATGAGAGGAGAGGTGATTGAG；GmEDS1-R：TCTTGAGGGTCGTTTCTGTTGA；GmACS1-F：CGTGGCGGCTGAGTCTCAG；GmACS1-R：ATTAAAATTGAATTTTATG；Gm-ERF1-F：AACCTTATAAATATCCATC；Gm-ERF1-R: AATTTAATTAACACTACTAACACAA；GmNPR1-F：AATTGACCAAGAGCTTCCGC；GmNPR1-R: CTACAGAAGCATCATTTTCAACATCTT；GmPR1-F：GCATCATGAATTTAGCCAACG；GmPR1-R：TTCCAGGTGACCAAGCAAGT；GmPR2-F：ATGGCTAAGTATCATTCAAGTGG；GmPR2-R：GTGCCTGTATAAGTGATTAGAAGG；GmPR5-F：ACTTCTACGACGTGAGCCTG；GmPR5-R：GTAGCTGCATTTTCCGGAT；Ubiquitin3-F: GTGTAATGTTGGATGTGTTCCC；Ubiquitin3-R: ACACAATTGAGTTCAACACAAACCG。

圖1 外源激素處理示意圖Fig.1 Schematic diagram of exogenous phytohormone treatments

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Graphpad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖，利用Photoshop軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果分析

2.1 ET、SA代謝途徑對(duì)SCN侵染響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析

利用MapMan將植物激素代謝通路進(jìn)行了可視化分析(圖2)。SCN早期侵染24 h后，寄主的ET和JA途徑變化較為顯著，其中14個(gè)與乙烯合成相關(guān)的基因顯著上調(diào)表達(dá)(Log2FC>1)，9個(gè)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因也顯著上調(diào)，表達(dá)倍數(shù)超過(guò)1(表1)。相比較而言，SA代謝通路受SCN脅迫影響較小，尤其是與合成途徑有關(guān)的基因表達(dá)增加倍數(shù)均低于1。

圖2 MapMan分析SCN侵染24 h后對(duì)寄主激素代謝途徑的影響Fig.2 MapMan-derived visualization of expression profiles of phytohormone metabolic pathways in soybean roots infected with nematode for 24 hours

2.2 外源添加ETH和SA對(duì)響應(yīng)基因表達(dá)的影響

為了明確葉片外源噴施ETH和SA是否能夠?qū)⑿盘?hào)從地上部分傳遞到根部以及有效作用濃度，檢測(cè)了不同激素濃度下ET、SA響應(yīng)基因的表達(dá)變化。qRT-PCR結(jié)果顯示，葉片噴施0.5 mM的ETH可顯著誘導(dǎo)大豆根內(nèi)ET響應(yīng)基因GmERS1上調(diào)表達(dá)(圖3A)。1 mM和2 mM的SA處理24 h后均可增加根部SA受體基因GmNPR1表達(dá)水平，尤其是2 mM濃度下GmNPR1表達(dá)上調(diào)了約3倍(圖3B)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用0.5 mM、2 mM分別作為ETH、SA的有效處理濃度。

注：數(shù)據(jù)為試驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(P<0.5)。下同。Note:Data are the mean±SD,P<0.5.The same is as below.圖3 qRT-PCR分析外源ETH(A)和SA(B)處理對(duì)ET、SA信號(hào)途徑激活情況Fig.3 Quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) data showing the response of the ET,or SA pathways in soybean roots at 24 h after ethephon (ETH) or salicytic acid (SA) treatments at different concentrations

表1 涉及乙烯、水楊酸代謝途徑的差異表達(dá)基因列表Table 1 Lists of differentially expressed genes involved in ET and SA pathways.

2.3 外源添加ETH和SA對(duì)SCN侵染及發(fā)育的影響

為了評(píng)估大豆根部ET和SA途徑激活后是否影響SCN侵染及生長(zhǎng)發(fā)育，接種線蟲(chóng)2天、35天后，分別統(tǒng)計(jì)了根內(nèi)J2數(shù)目和根系上的胞囊數(shù)。品紅染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，根內(nèi)線蟲(chóng)總數(shù)在ETH處理組和對(duì)照組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，外源噴施SA也沒(méi)有顯著改變SCN的侵染率(圖4A)。與對(duì)照相比，ETH處理后SCN的胞囊數(shù)顯著提高了29.4%，而噴施SA則導(dǎo)致胞囊數(shù)顯著下降了39.5%(圖4B)。以上結(jié)果表明，外源ETH處理有利于SCN在寄主根內(nèi)寄生，而SA外施可提高大豆對(duì)SCN抗性。

圖4 添加乙烯利(ETH)、水楊酸(SA)對(duì)大豆根內(nèi)線蟲(chóng)數(shù)目(A)和胞囊數(shù)變化(B)的影響Fig.4 Effects of exogenous ETH and SA treatments on the number of infected J2s (A) and cysts (B) in soybean roots

2.4 ET和SA信號(hào)在寄主與SCN間親和反應(yīng)中的相互作用

有研究報(bào)道，植物應(yīng)對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)性病原侵染時(shí)，SA與ET/JA途徑存在拮抗作用[9]。為了明確這兩者是否在SCN與寄主互作中也存在類(lèi)似交互作用，我們進(jìn)行ETH與SA共處理(ETH噴施24 h后進(jìn)行SA處理)。如圖5A所示，ETH可顯著抑制SA引起的誘導(dǎo)抗性。與SA單獨(dú)處理相比，ETH與SA共處理時(shí)SCN胞囊數(shù)恢復(fù)到了對(duì)照組水平，暗示兩者可能存在拮抗作用。qRT-PCR分析表明，ETH處理24h后，根內(nèi)SA合成酶基因GmICS2的表達(dá)被顯著抑制。但是，SA處理后在一定程度上可誘導(dǎo)ET響應(yīng)基因GmERF1上調(diào)表達(dá)(圖5B)。

注：A代表外源ETH處理能夠抑制SA對(duì)SCN的誘導(dǎo)抗性；B代表qRT-PCR分析ETH對(duì)SA途徑的調(diào)控作用，以及SA處理對(duì)ET途徑的調(diào)控作用。Note: A means ET-induced susceptibility to soybean cyst nematodes involved repression of SA-mediated defenses; B means quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed on RNA from root tissues at 24 h after ETH or SA treatments.圖5 ET和SA信號(hào)在寄主與SCN間親和反應(yīng)中的相互作用Fig.5 Cross-talk between the ABA and JA pathways during soybean-nematode interactions

2.5 外源ETH、SA處理對(duì)GmPRs基因表達(dá)的影響

PR是植物體內(nèi)一類(lèi)非常重要的防御基因，能夠被SA顯著誘導(dǎo)。在感病大豆與SCN間的親和性反應(yīng)中，早期SCN侵染(接種3天)可顯著提高GmPR1和GmPR5的轉(zhuǎn)錄水平，分別是未侵染組基因表達(dá)水平的2和3.5倍。然而，當(dāng)SCN取食點(diǎn)開(kāi)始建立時(shí)，GmPR1的表達(dá)被顯著抑制，并且GmPR5也降低到了對(duì)照水平(圖6)，暗示抑制大豆GmPR防御基因表達(dá)可能有助于SCN形成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。

此外，進(jìn)一步分析了外源添加ETH和SA后GmPRs對(duì)SCN寄生的響應(yīng)模式。和非處理組相比，SCN侵染3天后，ETH外施組的GmPR2表達(dá)降低了約50%，GmPR5被顯著誘導(dǎo)，而GmPR2和GmPR3在接種5天、8天后均下調(diào)表達(dá)(圖7A)。SA處理后，GmPR1和GmPR2分別在線蟲(chóng)侵染5天和8天后顯著上調(diào)表達(dá)。然而，GmPR2表達(dá)在接種5天后比非處理組顯著下調(diào)了約40%。GmPR5則隨著線蟲(chóng)侵染時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中接種5天、8天后其表達(dá)水平分別降低到非處理組的47%和32%(圖7B)。

圖6 SCN侵染對(duì)防御基因PR表達(dá)的影響Fig.6 Pathogenesis-related (PR) gene expression by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) in roots of susceptible soybean plants under 3 days and 5 days after inoculation with 400 invasive juveniles (J2s) of soybean cyst nematodes

注：基因相對(duì)表達(dá)量為激素處理組與非處理對(duì)照組的比值(虛線表示非處理對(duì)照組的表達(dá)量設(shè)為1)。Note:GmPR transcript levels of roots from ETH or SA-treated plants relative to those from untreated control plants (the value of unity indicates no change).圖7 qRT-PCR分析了寄主與SCN間不同親和性反應(yīng)時(shí)期外源ET(A)和SA(B)處理對(duì)防御基因PR表達(dá)的影響Fig.7 Time course analysis of pathogenesis-related (PR) gene expression by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) in soybean roots at 1,3,5 and 8 days post-treatment with ETH or SA

3 討 論

近年來(lái)，組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展為植物寄生線蟲(chóng)與寄主互作的研究提供了便利。有多個(gè)研究組利用轉(zhuǎn)錄學(xué)研究了不同抗、感栽培大豆品種、野生大豆資源對(duì)SCN侵染的分子響應(yīng)，數(shù)據(jù)分析顯示寄主與SCN互作過(guò)程均涉及到了植物激素代謝途徑[26-29]。Zhang等[27]利用RNA-Seq分析了SCN與抗、感野生大豆中基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在親和性反應(yīng)中ET合成酶基因GmACO、GmACS不同程度的上調(diào)表達(dá)，而在非親和性反應(yīng)中GmACS的表達(dá)顯著下調(diào)。本研究也證實(shí)，在SCN與大豆感病材料早期(接種24 h)的親和性反應(yīng)中，ET合成相關(guān)基因GmACS被顯著誘導(dǎo)。有試驗(yàn)證據(jù)也顯示，SCN侵染大豆數(shù)小時(shí)內(nèi)，ET合成前體ACC含量顯著上升，并且多個(gè)GmACS基因表達(dá)水平顯著升高[30]，進(jìn)一步說(shuō)明ET途徑在SCN早期入侵大豆感病品種具有重要作用。然而，SCN侵染后ET途徑基因表達(dá)模式似乎與線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期及寄主的品種有關(guān)。例如，盡管在親和性反應(yīng)中ET合成途徑被激活，然而其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達(dá)則變化不顯著[27]。有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在非親和性互作中SCN侵染也能激活ET合成途徑及下游基因表達(dá)[26,28]。這些研究說(shuō)明ET途徑可能在SCN發(fā)育的不同階段具有多重功能。對(duì)于SA途徑而言，已有的RNA-Seq分析結(jié)果表明，絕大多數(shù)SA途徑相關(guān)基因在SCN與寄主親和性反應(yīng)中變化較小，而非親和性反應(yīng)中被顯著活化，暗示了SA途徑在SCN抗性反應(yīng)中的正調(diào)控作用[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源EHT處理能顯著提升SCN繁殖能力，該結(jié)果進(jìn)一步支持了Bent等[22]研究結(jié)論，即抑制乙烯信號(hào)傳導(dǎo)會(huì)造成SCN在大豆中發(fā)育滯后，并且ET的合成抑制劑和功能拮抗劑處理均能顯著降低SCN雌蟲(chóng)數(shù)[30]，充分說(shuō)明激活ET途徑有利于SCN發(fā)育，這可能是SCN長(zhǎng)期進(jìn)化出的寄生策略。大量研究表明，SA途徑是植物抵御植物寄生線蟲(chóng)抗病反應(yīng)中的重要組分。本研究也發(fā)現(xiàn)，外源SA處理可增加大豆對(duì)SCN的抗病能力，這與Li等[28]外施SA減少SCN胞囊數(shù)的結(jié)果一致，并且多個(gè)大豆轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)也證實(shí)了過(guò)表達(dá)SA途徑關(guān)鍵組分可提高感病大豆抗SCN的能力[16,18]。外源EHT和SA共處理后SCN胞囊數(shù)較SA單獨(dú)處理有所提升，表明ET途徑的活化可能會(huì)部分抵消SA對(duì)SCN抗性的誘導(dǎo)作用，并且ET處理后SA合成基因GmICS2被部分抑制，暗示ET與SA在寄主與SCN互作用中可能存在拮抗作用。這也部分的解釋了外施ET后，SCN侵染會(huì)造成SA響應(yīng)基因GmPR2和GmPR3的表達(dá)出現(xiàn)不同程度下調(diào)，這可能與SA依賴(lài)GmICS2合成途徑被ET間接抑制有關(guān)。已有研究表明，GmWRKYs轉(zhuǎn)錄因子家族作為SA下游基因與SCN抗性密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)GmWRKYs后能顯著提高感病大豆對(duì)SCN的抗性[31]。本研究提供試驗(yàn)證據(jù)，外施SA提高SCN抗性與誘導(dǎo)GmPR1和GmPR2表達(dá)密切相關(guān)。利用大豆發(fā)根過(guò)表達(dá)GmPR基因可能會(huì)進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，這有待于今后深入探討。

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究利用轉(zhuǎn)錄組初步揭示了感病大豆與SCN間的早期親和性反應(yīng)中ET和SA途徑的表達(dá)變化，明確了SCN進(jìn)入寄主后J2幼蟲(chóng)移動(dòng)階段(侵染24 h)可顯著激活ET合成途徑，而對(duì)SA途徑影響較小。利用葉片外源噴施激素進(jìn)一步證實(shí)了ET途徑對(duì)于SCN寄生起正調(diào)節(jié)作用，而SA對(duì)寄主防御SCN具有正向功能，并且兩者可能存在拮抗作用。但是，在大豆與SCN間親和性反應(yīng)中，具體是那些功能基因在ET和SA交互中發(fā)揮關(guān)鍵作用仍不清楚，需要更多的試驗(yàn)證據(jù)去揭示它們之間的作用關(guān)系。