1個(gè)北村網(wǎng)狀肢端色素沉著癥大家系A(chǔ)DAM10基因突變研究

葛宏松，張 成，周 潔，曹婷婷，董 瑛，吳建平，冉 穎，張 莉，李 明

北村網(wǎng)狀肢端色素沉著癥(reticulate acropigmentation of Kitamura，RAK)是一種罕見(jiàn)的色素障礙性遺傳疾病，常染色體顯性遺傳，外顯率高[1]，1943年由 Kitamura和Akamatsu首次報(bào)道后，在日本、印度、中國(guó)、尼泊爾、土耳其、伊朗、沙特阿拉伯、意大利和拉丁美洲等國(guó)家和地區(qū)人群中均有單個(gè)病例及家系報(bào)道[2-4]。但該病與屈側(cè)網(wǎng)狀色素異常病(dowling-degos disease，DDD)等[1]色素障礙性疾病在臨床上有許多相似性，過(guò)去由于技術(shù)原因，只能根據(jù)這些疾病的分布、形態(tài)、排列、發(fā)病年齡和有無(wú)低色素斑點(diǎn)對(duì)各種實(shí)體進(jìn)行描述，同時(shí)該病本身也存在較大的臨床異質(zhì)性，往往造成很多誤診。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)展，一系列單基因色素障礙性疾病的致病基因被發(fā)現(xiàn)，這些疾病的診斷才逐漸清晰。2013年，Kono et al[5]首次確定了RAK的致病基因ADAM10，從而從基因水平區(qū)分開(kāi)與其它臨床表現(xiàn)相近的色素障礙性疾病。該研究報(bào)道了在中國(guó)人群RAK臨床特點(diǎn)及新的ADAM10 基因突變位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 家系成員調(diào)查先證者(46號(hào)患者)：女性，27歲，其女(53號(hào)患者)患有濕疹來(lái)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省兒童醫(yī)院皮膚科就診，發(fā)現(xiàn)其家族成員有多名患者，通過(guò)先證者聯(lián)系對(duì)家系進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，制作調(diào)查表以了解家族中各成員的臨床表現(xiàn)及發(fā)病情況，并繪制家系圖。

1.2 血細(xì)胞基因組DNA提取及分離經(jīng)過(guò)患者及其他正常人簽署遺傳性皮膚病研究知情同意書(shū)后，采集家系中外周血樣本(患者血樣10例，正常對(duì)照12例)，同時(shí)采集無(wú)血緣關(guān)系中國(guó)漢族正常對(duì)照血樣100例，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性和數(shù)量。使用血液DNA試劑盒[6](美國(guó)普羅米加公司)分離出DNA,該研究通過(guò)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，符合赫爾辛基宣言。

1.3 PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序在線(xiàn)(http://www.genome.UCSC.edu/)查取POFUT1、POGLUT1、ADAM10、KRT5 以及 ADAR1外顯子及其剪接區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)公布的基因序列設(shè)計(jì)ADAM10基因全部編碼外顯子的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法如下：5 min內(nèi)升溫至94 ℃后，持續(xù)變性(94 ℃、30 s)，退火(55～60 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、45 s)，共35個(gè)循環(huán)，最后充分延伸10 min。應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送上海安百隆生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行正向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與以上5種人類(lèi)基因組序列比較，如發(fā)現(xiàn)突變?cè)傩蟹聪驕y(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 臨床表型資料共發(fā)現(xiàn)該家系5代共有成員54人(其中患者16人,正常38人，男25人，女29人，11人已去世)，家系中男女均發(fā)病(其中男患者7人，3人去世,女患者9人，3人已去世)，無(wú)隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳模式(圖1)。家系中先證者及所有患者發(fā)病年齡在10歲以后，皮疹逐漸加重，查體：一般情況可，頸部及手部的網(wǎng)狀色素沉著斑，未見(jiàn)色素脫失斑，無(wú)掌跖部凹陷損害，無(wú)其它系統(tǒng)性病變發(fā)現(xiàn)，先證者皮損組織病理顯示，色素斑處表皮輕微萎縮，角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)黑素蓄積，基底層色素細(xì)胞增多(圖2)。

表1 擴(kuò)增ADAM10基因16個(gè)外顯子引物序列及基因片段長(zhǎng)度

圖1 RAK家系分布圖

圖2 RAK家系中先證者

圖3 RAK 家系患者ADAM10基因突變檢測(cè)

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果每個(gè)樣品提取得到2 μg以上的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示均無(wú)明顯拖尾，基因組DNA完整性較好。各PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶單一，片段大小符合預(yù)期?；驕y(cè)序結(jié)果與參考序列比對(duì)顯示均為特異性擴(kuò)增。引起色素異常的POFUT1、POGLUT1、KRT5 以及 ADAR1 基因未發(fā)現(xiàn)致病突變，而在ADAM10基因的第 4 號(hào)外顯子發(fā)生移碼突變，即 c.425-426 delGA; p.R142IfsX2，該突變?cè)谡?duì)照家系成員及無(wú)血緣關(guān)系的 100 例正常對(duì)照中并未檢測(cè)到，突變導(dǎo)致該蛋白截短，引起單倍型劑量不足，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生(圖3)。

3 討論

RAK的特征性表現(xiàn)為色素沉著、角狀、不規(guī)則的斑點(diǎn)樣病變，表面萎縮，在手、足背、頸部呈網(wǎng)狀排列[1]。病變通常開(kāi)始于兒童期或青春期，逐漸擴(kuò)展到四肢，很少發(fā)生在面部和眼瞼。隨著時(shí)間的推移，病變逐漸變暗，陽(yáng)光會(huì)使病情惡化。掌心、腳底和指骨背表面的皮紋有凹坑和裂口,伴掌跖皮膚紋理破壞。色素斑的病理檢查可見(jiàn)表皮萎縮，表皮突延長(zhǎng)，黑素增加。但不是所有患者均具有掌跖和指(趾)表面小凹陷，皮膚紋理破壞。本組患者表現(xiàn)為網(wǎng)狀的雀斑樣色素沉著斑分布于手足背面及頸部，皮疹表現(xiàn)為萎縮性的斑片，無(wú)色素減退斑及掌跖部蟲(chóng)蝕樣損害，所有患者大約10～20歲間發(fā)病，逐漸加重，未見(jiàn)其它系統(tǒng)性損害。

RAK的鑒別診斷以網(wǎng)狀或點(diǎn)狀色素沉著為表現(xiàn)的疾病，包括網(wǎng)狀色素性皮病[1](dermatopathia pigmentosa reticularis,DPR)：2歲左右嬰兒期發(fā)病，軀干部多見(jiàn)，可累及頸、肩、大腿等部位,伴有色素沉著、非瘢痕性禿發(fā)和甲病三聯(lián)征，組織病理為真皮上部大量色素及噬色素細(xì)胞。遺傳性泛發(fā)性色素異常癥(dyschromatosis universalis hereditaria，DUH)：大多數(shù)1歲內(nèi)發(fā)病，晚發(fā)偶見(jiàn),全身皮膚甚至黏膜可見(jiàn)界限清楚的棕色及白色斑，混雜分布，主要累及軀干及四肢近端，偶伴系統(tǒng)損害，組織病理示表皮色素顆粒增加及色素失禁，Xing et al[7]將此病的致病基因定位于6號(hào)染色體6q24.2-1q25.2區(qū)域。遺傳性對(duì)稱(chēng)性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH)：一種肢端色素沉著病,通常起于嬰兒期或幼兒期，青春期明顯，持續(xù)終身，表現(xiàn)為手、足背點(diǎn)狀黃褐色至褐色斑點(diǎn)夾雜脫色素斑疹，構(gòu)成網(wǎng)格樣圖，組織病理表皮下層色素增加真皮上層噬色素細(xì)胞多見(jiàn)及少量炎性淋巴細(xì)胞，脫色素斑處基底層色素減少甚至消失。2003年Zhang[8]課題組首次將DSH致病基因定位于1號(hào)染色體 1q11-1q21區(qū)域內(nèi)，隨后發(fā)現(xiàn)致病基因ADAR[9]。家族性進(jìn)行性色素沉著癥褐色斑出生后發(fā)生，隨年齡增大逐漸增多，好發(fā)于眼周、口周、頸側(cè)、軀干、四肢及手足背部雀斑樣斑點(diǎn)，其間可見(jiàn)正常皮膚，病理示基底層色素增加、色素細(xì)胞正常，Wang et al[10]在國(guó)際上首先明確該病的致病基因?yàn)镵ITLG。DDD一般為20歲以后發(fā)病,主要見(jiàn)于頸、乳房下、腋窩、臀間、腹股溝等屈側(cè)花紋樣棕褐色斑，也可累及軀干和前臂， 近年來(lái)，關(guān)于RAK與DDD共存于同一患者的報(bào)道越來(lái)越多，但在2006年，Betz et al[11]首先發(fā)現(xiàn)部分DDD是由KRT5基因突變所致；在2013年[12]，排除了KRT5基因突變后，國(guó)際上首次報(bào)道了泛發(fā)性DDD是由POFUT1基因突變所致，Kono et al[5]首次應(yīng)用全外顯子組測(cè)序確定ADAM10突變是造成RAK的原因，這是一種不同于DDD等其他色素POFUT異常性疾病，同時(shí)，在5個(gè)RAK家系中，確定了6種ADAM10基因突變。在RAK家族中發(fā)現(xiàn)了ADAM10基因突變，該基因編碼鋅金屬蛋白酶、崩解素和ADAM 10。眾所周知，ADAM 10參與了皮膚中各種基質(zhì)的外域脫落，因此，遺傳研究顯示RAK和DDD是不同的疾病。2018年，Pan et al[13]在2例單獨(dú)發(fā)病的中國(guó)RAK患者中，通過(guò)測(cè)序分析檢測(cè)出ADAM10內(nèi)含子突變(c.2026-2A >G)。ADAM10蛋白參與多種生物過(guò)程，包括調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞中黑色素的分布和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。迄今為止，包括本組患者在內(nèi)，共報(bào)道了14個(gè)ADAM10突變導(dǎo)致RAK。在這些患者中，甚至在ADAM10突變相同的家庭成員中，也發(fā)現(xiàn)了色素沉著和凹陷分布的多樣性，以及其他特征的存在，如特應(yīng)性皮炎、腦膜瘤和足底角化病。RAK的表型復(fù)雜性提示，除了ADAM10突變外，其他迄今未知的環(huán)境或遺傳因素也可能與RAK的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

1998年，Yavari et al[14]通過(guò)FISH技術(shù)把ADAM10基因定位于15q22。人類(lèi)ADAM10的mRNA含3 410個(gè)堿基，16個(gè)外顯子，基因的上游區(qū)域可能存在BRN2、SREBP、OCT1和NFKB等的結(jié)合位點(diǎn)。Hartmann et al[15]建立了ADAM10缺陷小鼠，該小鼠在胚胎9.5 d死亡，通過(guò)原位雜交顯示，該小鼠NOTCH 靶基因 Hes5在神經(jīng)管中的表達(dá)下降，而NOTCH配體DLL1的表達(dá)則增加，表明 ADAM10在NOTCH信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步的研究還顯示，ADAM10 是小鼠邊緣區(qū)B細(xì)胞發(fā)育必不可少的。缺乏ADAM10的B細(xì)胞 NOTCH2信號(hào)通路嚴(yán)重受損，ADAM10作為CD23的釋放酶，可能以某種不可被替代的機(jī)制，啟動(dòng)了NOTCH2信號(hào)通路。Kono et al[5]報(bào)道ADAM10單倍體功能不足引起無(wú)毛小鼠皮膚上雀斑樣色素沉著，小鼠的色素斑首發(fā)于四肢背側(cè)，成年鼠軀干可觀察到彌漫性色素沉著。這一表現(xiàn)類(lèi)似于人類(lèi)的RAK。但兩者明顯的區(qū)別是，小鼠出現(xiàn)色素沉著需要同時(shí)具備ADAM10突變致單倍體功能不足和無(wú)毛基因純合突變兩個(gè)條件。而人類(lèi)RAK患者，全身毛發(fā)正常，且經(jīng)檢測(cè)，也不存在無(wú)毛基因的任何突變。

綜上，雖然以前的研究已經(jīng)明確RAK是由ADAM10基因異常所致，也已經(jīng)建了兩個(gè)ADAM10突變小鼠模型，但這兩個(gè)模型一個(gè)在胚胎期即死亡，另一個(gè)需同時(shí)合并無(wú)毛基因的純合突變，均與人類(lèi)RAK有明顯的不同，不適合進(jìn)行 RAK發(fā)病機(jī)制的研究。所以，ADAM10基因突變?nèi)绾斡绊懭祟?lèi)的黑素形成，如何導(dǎo)致人類(lèi)皮膚的色素代謝障礙，最終使患者的皮膚表現(xiàn)出RAK 表型，需要進(jìn)一步研究。本研究中患者的臨床僅表現(xiàn)為頸、手部的網(wǎng)狀色素沉著斑，無(wú)掌跖部凹陷損害，新ADAM10基因4號(hào)外顯子突變的發(fā)現(xiàn)，豐富了該病突變庫(kù)，同時(shí)對(duì)該家族成員今后的產(chǎn)前診斷、優(yōu)生優(yōu)育有一定的幫助。