蛋白芯片和質(zhì)譜檢測技術(shù)在干眼癥中的應(yīng)用

楊延婷，張 丹，洪 玨，劉 婕，董小慶，郭瀟聰，馬曉芃，

0引言

干眼癥是目前眼科門診最常見的一種疾病。其發(fā)病率逐年升高并趨于低齡化，流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率為2%～50%，主要以女性患者為主[1-4]。國際淚膜和眼表協(xié)會干眼疾病工作組第二次會議定義干眼癥為“一種多因素性眼表疾病，其主要表現(xiàn)為淚膜不穩(wěn)定，并伴有多種眼部癥狀。其病因包括淚膜不穩(wěn)定、高滲透性、眼表炎癥損傷以及神經(jīng)感覺異常等[5]”。干眼癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床診斷常以患者癥狀為基礎(chǔ)，但是患者自覺的癥狀和體征往往缺乏一致性[6]。長期以來干眼癥診斷缺少“金標(biāo)準(zhǔn)”，并且潛在的發(fā)病機(jī)制很難被發(fā)現(xiàn)[7-8]。研究證明只有10%的有癥狀的患者才能獲得臨床確診[9]，而漏診誤診的現(xiàn)象時有發(fā)生。此外，由于缺少明確的標(biāo)志物，新的干眼癥藥物的開發(fā)常常受到阻礙[10]。所以尋找有效的干眼癥標(biāo)志物不但可以優(yōu)化診斷，指導(dǎo)分子靶向治療并監(jiān)測治療反應(yīng)[11]。

淚膜的構(gòu)成主要為水液、蛋白質(zhì)、脂類、鹽和其他有機(jī)分子等。蛋白質(zhì)主要來源于淚腺，還有部分來源于附屬淚腺、瞼板腺、Zeis和Moll皮脂腺、以及角膜和結(jié)膜細(xì)胞[12]。研究發(fā)現(xiàn)正常人在刺激狀態(tài)下淚水中總蛋白濃度約為8.1μg/μL，而未受刺激時約為22.7μg/μL[13]。這些蛋白質(zhì)具有保護(hù)眼表免受潛在病原體干擾的作用，并且部分蛋白質(zhì)還參與調(diào)節(jié)眼表角結(jié)膜修復(fù)的過程[14-16]。與正常人比較，干眼癥患者眼表淚液中蛋白質(zhì)表現(xiàn)出明顯的變化和差異[17]，此外，干眼癥患者如果受到干擾因素(吸煙、配戴隱形眼鏡等)可導(dǎo)致眼表蛋白的重新分布[18-19]，說明淚液蛋白表達(dá)的變化與多種全身性或眼部疾病以及環(huán)境干擾有關(guān)。

目前常用的檢測淚液蛋白的方法有液相多重珠陣列(multiplex bead array)、固相芯片膜微陣列(membrane microarray)、表面增強(qiáng)激光解附離子化飛行時間質(zhì)譜(surface-enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)、同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)等。本文通過系統(tǒng)查閱近年來蛋白組學(xué)技術(shù)在干眼癥中的應(yīng)用進(jìn)展，評估兩大類蛋白質(zhì)檢測方法的優(yōu)缺點，為進(jìn)一步提高干眼癥的診斷和治療提供思路。

1蛋白芯片技術(shù)在干眼癥中的應(yīng)用

由于眼表組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜精細(xì)，眼表相關(guān)蛋白成分的檢測和分析有一定難度。檢測時取材困難甚至?xí)p害眼表，而且獲得的組織樣本量也較為有限。淚液作為眼表的薄層細(xì)胞外液，可以通過非侵入性方法收集。對淚液樣本的相關(guān)研究已證實其在發(fā)現(xiàn)干眼癥相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)記物方面的潛力，即便是少量淚液也足夠用于分析。蛋白芯片和質(zhì)譜技術(shù)因其具有高通量性、敏感性、可重復(fù)性、穩(wěn)定性和自動化的特點，已在干眼癥研究中被用來識別特定的淚液蛋白成分[20-22]，有助于揭示干眼癥患者淚液蛋白的差異表達(dá)，并進(jìn)一步指導(dǎo)臨床藥物和治療方法的研究。

1.1液相多重珠分析液相多重珠分析(multiplex bead analysis)技術(shù)是一種基于珠子的免疫測定方法，結(jié)合了細(xì)胞計數(shù)珠的測定和多重ELISA法。最早見于1950年，由Singer和Plotz利用聚合物微珠用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的血清學(xué)診斷[23]，經(jīng)過不斷的改進(jìn)升級后，這種微珠檢測方法已被廣泛研究并應(yīng)用于不同疾病領(lǐng)域[24]。目前常用的方法是通過96微孔板和雙激光，基于液態(tài)流動的分選和檢測平臺，將特異性抗體包被在顏色編碼的微球珠子上，并與檢測樣本(淚液、血漿、血清、尿液、腦脊髓液等)一起孵育[25]。通過珠子捕獲分析物后，引入生物素化的熒光抗體或者鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(Strept-PE)綴合物以完成測試反應(yīng)(圖1)。

圖1 多重珠微陣列示意圖。

ELISA方法耗時并且成本高，通常一次只能測量一種分析物，而微珠技術(shù)則可同時分析量化多種分析物。該技術(shù)通常用于檢測低豐度或難以檢測的蛋白質(zhì)，包括代謝標(biāo)記，磷酸化蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子等。Luminex多重免疫珠測定法是液相多重珠分析技術(shù)中最常用方法[26-27]。Luminex技術(shù)最大的優(yōu)勢是可在單個反應(yīng)容器中分析多達(dá)100種多種細(xì)胞因子，具有高通量、低成本和可檢測更小樣本體積的特點。

應(yīng)用Luminex技術(shù)檢測干眼癥患者的淚液發(fā)現(xiàn)，與正常組比較蒸發(fā)過快型干眼癥患者淚液中表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、趨化因子(Fractalkine CX3CL1、IL-8/CXCL8)、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-1Ra)、干擾素誘生蛋白(IP-10/CXCL10)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的濃度顯著增加[27]。另外一項基于臨床藥物療效的研究應(yīng)用這項技術(shù)發(fā)現(xiàn)利用海藻糖/透明質(zhì)酸鹽滴眼液治療干眼癥患者，可以減少淚液中IL-1β，IL-6和IL-8的表達(dá)[28]。需要注意大多數(shù)Luminex技術(shù)主要設(shè)計用于檢測較大的樣品體積如10～25mL，樣本以血漿和血清為主。而對于少量的淚液樣本，研究者只能選擇匯總多個淚液樣本進(jìn)行檢測，這樣一定程度上增大了誤差，存在異常值而導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。所以利用這項技術(shù)檢測干眼癥患者淚液蛋白質(zhì)的研究并不是很多。

1.2膜/抗體微陣列膜/抗體微陣列(membrane microarray/ antibody array)技術(shù)是通過將微量蛋白質(zhì)固定于載體，利用高靈敏度讀取系統(tǒng)對樣品進(jìn)行分析的技術(shù)，屬于固相蛋白芯片的一種[29-30]。它能夠?qū)⒏鞣N蛋白質(zhì)(例如抗體、抗原、酶等)固定在蛋白質(zhì)芯片上，同時檢測實驗中樣品不同的參數(shù)，且僅需要比其他方法更少的樣品。理想的載體表面有滲透濾膜(如硝酸纖維素膜)或包被了不同試劑(如多聚賴氨酸)的載玻片。然后將樣品(淚液、尿液、間質(zhì)液、尿液、滲出液等)直接施加到膜上，經(jīng)洗滌、純化，再進(jìn)行確認(rèn)和生化分析，利用熒光、化學(xué)發(fā)光及酶和射線照相檢測系統(tǒng)進(jìn)行靈敏的蛋白質(zhì)定量分析[31]。這種技術(shù)檢測蛋白質(zhì)含量可以精確到皮克水平(pg/mL)。微陣列技術(shù)作為一種高通量方法，可以利用單個樣品同時研究多種蛋白質(zhì)，非常適用于樣本量較少的淚液研究。該技術(shù)通常用于分析細(xì)胞信號蛋白和細(xì)胞因子[32]，與其他蛋白組學(xué)技術(shù)相比，具有高通量、樣本少、花費低、不需要專業(yè)培訓(xùn)及大量的儀器設(shè)備等優(yōu)勢[33]。

采用此項技術(shù)已發(fā)現(xiàn)干眼癥患者的淚液中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3、MMP-10以及多種生長因子和細(xì)胞因子可能在干眼癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[34]。水液不足型干眼癥患者與正常對照組比較，Cystatin SN胱抑素的值升高至3倍。研究還發(fā)現(xiàn)淚液生成不足合并脂質(zhì)異常的患者，患者的蛋白質(zhì)含量幾乎與單純脂質(zhì)異?；颊呦喈?dāng)[35]。患有水液不足型并合并脂質(zhì)異常的患者顯示大多數(shù)測試蛋白質(zhì)的水平升高[36]。

在微陣列技術(shù)檢測淚液蛋白過程中，由于蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在以及淚液特異性基質(zhì)效應(yīng)的潛在影響，即存在許多對塑料、捕獲抗體和IgG具有親和力的因子產(chǎn)生了一系列復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)，可能會導(dǎo)致文獻(xiàn)中報道的ELISA驗證結(jié)果的差異[33, 37]。由于這種檢測手段中的暈染效應(yīng)、基質(zhì)效應(yīng)、圖像捕獲方法以及捕獲和探針抗體之間的串?dāng)_可能會極大地影響信噪比并限制獲得有意義結(jié)果的能力，所以有必要驗證每個陣列的特異性和有效性[38]。雖然膜微陣列可提供廉價的篩選工具，但該技術(shù)在分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)環(huán)境缺乏足夠的嚴(yán)謹(jǐn)性[39]。而且操作需要消耗大量的時間，缺少標(biāo)準(zhǔn)化程序，并且捕獲和探針抗體之間可能存在交叉反應(yīng)[25]。所以雖然該方法是一種具有臨床潛力的診斷工具，但需要進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化研究來驗證其穩(wěn)定性。

2質(zhì)譜技術(shù)在干眼癥中的應(yīng)用

2.1 SELDI-TOF-MS近年來質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)已經(jīng)成為疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的一個新選擇，因為它可以用于檢測和定量樣品中的大多數(shù)蛋白質(zhì)，還可以檢測細(xì)胞功能和新陳代謝的變化[40-41]。質(zhì)譜技術(shù)主要由三部分構(gòu)成，包括電離、質(zhì)量分析和檢測[42]。四種最常見的質(zhì)量分析儀是TOF、四極桿、四極桿/離子阱和傅里葉變換離子回旋共振[42]。常用的電離技術(shù)包括ESI、MALDI和SELDI[43]。其中表面增強(qiáng)激光解附/電離飛行時間質(zhì)譜SELDI-TOF-MS技術(shù)由Hutchens和Yip等在1993年首次研究提出[20]，并于1997年商業(yè)化為ProteinChip系統(tǒng)。后被廣泛用于各類疾病特異性生物標(biāo)志物的檢測和篩選，并取得了一系列的突破性進(jìn)展[44]。由于這項技術(shù)靈敏度高，檢測速度快，特別適合如淚液等小樣本的研究，已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[45-47]。

由于檢測分析只需少量的樣本，因此淚液樣本的MS分析已經(jīng)證明它在發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)記物方面具有較大潛力[48-50]。SELDI-TOF-MS對低分子量范圍的蛋白質(zhì)的檢測特別敏感，適合從肽和小分子蛋白質(zhì)來區(qū)分干眼和健康眼的區(qū)別。通過多變量統(tǒng)計技術(shù)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)，并通過串聯(lián)MS純化和鑒定最重要的生物標(biāo)志物，可以精確檢測到淚液蛋白和肽的復(fù)合模式，如脂質(zhì)運載蛋白和溶菌酶等。

SELDI-TOF-MS技術(shù)的一大優(yōu)勢是可根據(jù)選擇的不同色譜表面，蛋白質(zhì)和肽可以通過其生化特性富集或選擇性地從表面沖洗掉。這樣更容易得到真實的不受干擾的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)干眼癥患者的溶菌酶顯著降低[51]，同樣利用反相芯片以及CM10陣列檢測發(fā)現(xiàn)淚液中降低的溶菌酶峰[52]。此外Temel等[53]發(fā)現(xiàn)高含水量的隱形眼鏡對淚液溶菌酶生理學(xué)的干擾最大。這個發(fā)現(xiàn)與臨床相符，即每天或晚上配戴隱形眼鏡都會增加角膜炎癥和感染的發(fā)生[54]。有研究通過SELDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了6個可用于干眼癥標(biāo)記的符合嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)及多肽[21]。與健康受試者相比，發(fā)現(xiàn)富含溶菌酶脯氨酸蛋白4(lysozyme proline-richprotein 4，LPRR4)在蒸發(fā)過快型和蒸發(fā)過快合并脂質(zhì)異常患者中減少，并且乳房珠蛋白B(mammaglobin B)和親脂素A(lipophilin A)以及鈣粒蛋白(S100A8)在這些患者中增加。通過2D電泳和DIGE凝膠電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)LPRR4在幾種類型的干眼癥中顯著下調(diào)。基于淚液LPRR4的差異表達(dá)及其與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性，該蛋白被提出作為潛在的干眼癥生物標(biāo)志物[55]。這項技術(shù)最大的不足是：SELDI-TOF的多數(shù)MS光譜檢測蛋白的分子量介于1.5和20kDa之間，而人體中的大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量大于20kDa，因此當(dāng)SELDI-TOF-MS用于淚液分析時，易造成蛋白質(zhì)信息丟失。

2.2 iTARQiTRAQ即為同位素編碼的共價標(biāo)簽技術(shù)，利用標(biāo)簽特異性地標(biāo)記蛋白質(zhì)消化分解后所形成的小分子肽的N-末端和側(cè)鏈胺。因此使用iTRAQ技術(shù)可以標(biāo)記樣品中的每個肽，可以進(jìn)行更好地蛋白質(zhì)鑒定和定量。并且iTRAQ特別適用于研究多種實驗條件，由于它不區(qū)分具有某些物理化學(xué)特性的肽，因此與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比，iTRAQ可以大大增加鑒定蛋白質(zhì)的數(shù)量。iTRAQ技術(shù)可以直接得到蛋白的定性和相對定量信息，可利用統(tǒng)計學(xué)方法快速篩選出各個組別的差異蛋白，且能更好的結(jié)合基因組或轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，有利于后續(xù)研究。如果樣本數(shù)多于8個，還可以在每次上機(jī)時設(shè)置內(nèi)參，每個樣本先跟內(nèi)參比較，再相互比較(排除操作、環(huán)境和儀器誤差)，從而實現(xiàn)多組樣本間的差異蛋白分析。

應(yīng)用iTRAQ技術(shù)在干眼癥的研究中發(fā)現(xiàn)干眼癥蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生改變，如α-烯醇酶(a-enolase)、α-1-酸糖蛋白1、S100A8、S100A9、S100A4和S100A11上調(diào)，脂質(zhì)運載蛋白-1、溶菌酶、催乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)和乳鐵蛋白的下調(diào)[17, 56]。有研究者利用iTRAQ技術(shù)定量分析大鼠淚液中的蛋白，共分析了269種蛋白，發(fā)生差異表達(dá)的蛋白有118種[57]。另一項關(guān)于干眼癥動物模型基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示，針刺前收集的淚液蛋白質(zhì)與針刺后蛋白質(zhì)顯著不同。通過iTRAQ總共鑒定了28種淚蛋白，與針灸相關(guān)的是6種上調(diào)蛋白(淚脂質(zhì)蛋白、α-1-抗蛋白酶、富含組氨酸的糖蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、α-2-HS-糖蛋白)和5種下調(diào)蛋白(Annexin A1、血清淀粉樣蛋白A-3蛋白、解旋酶樣轉(zhuǎn)錄因子、15kDa蛋白A、S100A9)[58]。這項研究結(jié)果有助于推動傳統(tǒng)針灸醫(yī)學(xué)對干眼癥治療的機(jī)制研究。此外，還有運用此技術(shù)研究兩種飛秒LASIK手術(shù)造成的干眼癥淚液中蛋白質(zhì)的變化，研究發(fā)現(xiàn)Visumax術(shù)后干眼淚液中有更多上調(diào)的蛋白質(zhì)，而Intralase術(shù)后干眼患者淚液中擁有更多下調(diào)的蛋白[59]。與Visumax手術(shù)的眼睛相比，Intralase操作的眼睛的乳鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-2糖蛋白1鋅、溶菌酶和乳過氧化物酶的含量顯著降低。

iTRAQ技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)，被認(rèn)為是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的有效重要方法[60]，可以用于鑒定診斷和治療干眼癥和其他炎性眼表面病癥的靶蛋白。有研究運用此項技術(shù)針對結(jié)膜炎患者的淚液進(jìn)行分析，通過檢測了大量肽成功鑒定了78種蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)結(jié)膜炎患者淚液中血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅素結(jié)合蛋白的水平比對照淚液水平高100倍并且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。與正常人相比，結(jié)膜炎患者血紅素結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳房珠蛋白B等在樣品中明顯過表達(dá)[56]。這項技術(shù)最大的缺點是檢測一些高豐度的蛋白時這些蛋白會大量分布于小孔中，可能會抑制其他蛋白的檢出效果。

3總結(jié)與展望

基于以上研究發(fā)現(xiàn)干眼癥患者的淚液蛋白質(zhì)組譜改變，主要表現(xiàn)為炎癥標(biāo)志物的上調(diào)和保護(hù)性蛋白水平的降低。不同蛋白組學(xué)研究方法將干眼癥患者與正常人的淚液對比，發(fā)現(xiàn)S100A8(鈣粒蛋白A)、α-烯醇酶、催乳素誘導(dǎo)蛋白(PIP)、脂質(zhì)運載蛋白-1、S100A9(鈣粒蛋白B)等在干眼患者淚液中升高。這些淚液蛋白主要參與眼表防御，其中溶菌酶、乳鐵蛋白、LCN-1和防御素是先天免疫防御系統(tǒng)的必要組分[61-62]。但是這些研究結(jié)果也表明，不同形式的干眼癥可能具有可用于診斷的不同淚膜蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物。使用適當(dāng)?shù)膶φ者M(jìn)行生物標(biāo)志物驗證也很重要，以確保潛在的生物標(biāo)志物用于它們真正代表的病理生理狀況。

本綜述發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中已經(jīng)有許多基于蛋白芯片和質(zhì)譜技術(shù)的有價值的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但是無法滿足臨床蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物報告的大部分要求。許多潛在的生物標(biāo)志物已被確定與干眼癥的許多臨床方面有關(guān)，包括診斷、疾病活動和預(yù)后。但是缺乏進(jìn)一步的實驗技術(shù)的驗證，從而可信度不夠高。通過研究閱讀相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)針對干眼癥淚液蛋白組學(xué)研究的文獻(xiàn)都比較老舊，幾乎沒有近3a的相關(guān)文章，并且缺乏大樣本的研究。其原因可能是由于各類技術(shù)并未有顯著的更新和更精確的改進(jìn)，或者由于對于干眼的研究比較局限，并未發(fā)揮出其應(yīng)有的價值。在未來的干眼癥生物標(biāo)志物研究中，最需要解決的問題是使用更大樣本量，以及在獨立的患者群體中驗證已經(jīng)識別的生物標(biāo)志物。這樣的生物標(biāo)志物應(yīng)該成為研究重點，并在未來使用特征良好的患者群體進(jìn)行更大規(guī)模的多中心臨床研究，以證明其臨床應(yīng)用價值。