基于基因芯片數(shù)據(jù)的精原細胞瘤生物信息學分析*

瞿根義 湯 乘 徐 勇 陽 光 段紅桃 王佳威 向茂林

1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院泌尿外科；2.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬株洲醫(yī)院超聲科（湖南株洲412007）

在一般人群中，睪丸生殖細胞腫瘤（TGCT）是相對罕見的腫瘤， 在15 至44 歲男性中是常見的惡性腫瘤之一[1]，睪丸根治性切除術是標準的治療方法，近幾年，免疫療法和基因療法被認為是很有潛力的治療策略[2]。但精原細胞瘤具體發(fā)生發(fā)展機制目前仍未闡明， 因此研究精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制， 對于該疾病早期診斷和干預以及預測疾病預后具有重要的價值。

基因芯片技術是高效的、 大規(guī)模的基因數(shù)據(jù)獲取技術， 可以同時研究數(shù)以萬計的基因表達與疾病之間的關系，尤其是對于腫瘤的機制研究。 生物信息學是將計算機技術和分子生物學相結(jié)合的技術， 為基因的研究提供了明確的方向，揭示大量生物信息所含的奧秘。在本研究中， 我們采用生物信息學技術對精原細胞瘤相關基因芯片數(shù)據(jù)GSE8607 進行整合和分析， 篩選出差異基因， 并進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，制作PPI 互作網(wǎng)絡，以求尋找精原細胞瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵基因，并探索用于診斷、治療和預測預后的潛在的候選基因或分子。

材料和方法

一、材料

在GEO Datasets (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫中以“seminoma” 為關鍵詞進行檢索， 獲得由Klein-HitpassL 等[3]提交的GSE8607 芯片數(shù)據(jù)。GSE8607的芯片平臺是GPL8300。 該數(shù)據(jù)集包含40 個精原細胞瘤樣本和3 個健康睪丸樣本。 登錄號GSM213467-GSM213469 為正常睪丸樣本數(shù)據(jù)，GSM213470-GSM213510 為精原細胞瘤樣本數(shù)據(jù)。 40 例精原細胞瘤患者的平均年齡為37.6 歲（23～56 歲），對照組為53 歲。

二、方法

（一）獲取差異基因

從GEO database 下載精原細胞瘤相關的基因芯片數(shù)據(jù)GSE8607，利用R 軟件及affy、limma、ggplot2 等R程序包進行數(shù)據(jù)挖掘和生物信息學分析。 對GSE8607表達譜數(shù)據(jù)進行差異表達基因篩選。以P＜0.05 且差異倍數(shù)1.5 倍獲取差異表達基因。

（二）差異表達基因的GO 富集分析和KEGG 富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(DAVID;https://david.ncifcrf.gov)[4]對篩選的顯著差異基因進行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，P＜0.05 為統(tǒng)計學具有顯著差異，應用R 軟件及相應的clusterProfiler 包進行注釋及可視化。

（三）差異表達基因的PPI 網(wǎng)絡分析

STRING 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)用于識別己知和預測蛋白與蛋白之間PPI 的相互作用[5]。 使用STRING 對差異表達基因進行分析并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，使用Cytoscape 軟件中的MCODE 獲取主要的PPI 網(wǎng)絡，以及Cytohubba 插件篩選前10 位Hub 基因。

結(jié) 果

一、精原細胞瘤差異表達基因篩選

從GEO 數(shù)據(jù)庫下載精原細胞瘤相關基因芯片GSE8607 中共篩選出精原細胞瘤差異表達基因1142個，與健康對照組相比，其中表達上調(diào)基因687 個，表達下調(diào)基因455 個，并繪制火山圖，（圖1）

圖1 兩組樣本之間數(shù)據(jù)的差異表達

二、 精原細胞瘤差異表達基因的GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果

通過GO 富集分析和KEGG 通路富集分析篩選的差異表達基因的生物學功能， 在GO 富集分析中包括生物學過程（biological process，BP）、 細胞組成（cell composition，CC）和分子功能（molecular function，MF），在BP 中差異基因主要富集于炎癥反應、免疫反應和細胞信號轉(zhuǎn)導， 在CC 中差異基因主要富集于細胞核、細胞質(zhì)和胞質(zhì)溶膠，在MF 中差異基因主要富集于蛋白結(jié)合和細胞粘附分子結(jié)合， 在KEGG 通路分析中主要富集于I 型糖尿病信號通路、移植抗宿主病信號通路。 主要富集結(jié)果見（表1）和（圖2）。

表1 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析結(jié)果

圖2 A 差異基因GO 富集可視化，B 差異基因KEGG 通路富集可視化

三、差異表達基因的PPI 網(wǎng)絡分析結(jié)果

通過STRING 數(shù)據(jù)庫對精原細胞瘤差異表達基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，進一步利用Cytoscape 軟件中的MCODE獲取主要PPI 網(wǎng)絡（見圖3）， 再利用Cytoscape 軟件中Cytohubba 篩選PPI 網(wǎng)絡中的連接程度前10 位hub 基因（見圖4），分別是：C3AR1、PENK、ADORA1、P2RY14、ADCY7、CCL5、CCR5、CCL4、CCL19、CCR7。

圖3 差異表達基因PPI 網(wǎng)絡的三大主要模塊：（A）模塊1；（B）模塊2；（C）模塊3

圖4 PPI 網(wǎng)絡篩選的top 10 hub 基因

討 論

睪丸生殖細胞腫瘤可分為精原細胞瘤以及非精原細胞瘤型睪丸腫瘤， 其中精原細胞瘤最為常見， 是15至44 歲男性常見的惡性腫瘤之一[1]。 睪丸根治性切除術是標準的治療方法，但預后往往較差，且精原細胞瘤具體發(fā)生發(fā)展機制目前仍未闡明， 因此研究精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制具有重要臨床意義。 隨著基因測序技術的發(fā)展， 以及第二代基因測序技術的出現(xiàn)，為生物信息學提供了豐富的資源[6]。 結(jié)合基因芯片大數(shù)據(jù)的生物信息學分析， 從遺傳學角度了解其分子機制對早期診斷、 治療以及疾病預后的預測具有重要意義。

本研究利用生物信息學技術，首先從GEO database下載精原細胞瘤相關的基因芯片數(shù)據(jù)GSE8607， 包括40 例精原細胞瘤樣本數(shù)據(jù)和3 例健康睪丸樣本數(shù)據(jù)，采用R 軟件進行數(shù)據(jù)挖掘， 共挖掘顯著差異基因1142個，其中表達上調(diào)基因687 個，表達下調(diào)基因455 個，用DAVID 在線工具對差異表達基因進行富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在BP 中差異基因主要富集于炎癥反應、免疫反應和細胞信號傳導，在CC 中差異基因主要富集于細胞核、細胞質(zhì)和胞質(zhì)溶膠，在MF 中差異基因主要富集于蛋白結(jié)合和細胞粘附分子結(jié)合， 在KEGG 通路分析中主要富集于I 型糖尿病信號通路、移植抗宿主病信號通路。 進一步通過STRING 數(shù)據(jù)庫對精原細胞瘤差異表達基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白調(diào)節(jié)點主要集中在C3AR1、PENK、ADORA1、P2RY14、ADCY7、CCL5、CCR5、CCL4、CCL19、CCR7， 對 這10個hub 基因進行文獻挖掘， 我們發(fā)現(xiàn)這些基因在腫瘤中均發(fā)揮著重要的作用。

PENK 主要存在于細胞質(zhì)基質(zhì)， 可以充當神經(jīng)遞質(zhì)，研究指出PENK 和PENK 衍生的多肽與胃癌、頭頸癌和胰腺癌的發(fā)展密切相關[7-9]。PENK 與精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展相關的具體機制還需進一步研究。 ADORA1 是與細胞凋亡和脂質(zhì)代謝相關的上調(diào)基因之一，ADORA1 的激活可抑制不同類型的腫瘤細胞的增殖， 包括人LoVo、 白血病MOLT-4、 乳腺癌T47D、HS578T 和MCF-7[10]。 ADORA1 作為精原細胞瘤發(fā)病過程中可能起到關鍵作用的基因之一，ADORA1 的激活劑可能成為精原細胞瘤今后靶向治療的方向。 ADCY7 是哺乳動物九種跨膜腺苷酸環(huán)化酶之一， 可催化細胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生。 ADCY7 缺乏導致白血病細胞生長緩慢，凋亡增加和c-Myc 表達降低，因此ADCY7 靶向抑制劑可能是治療白血病的新策略[11]，也可能成為治療精原細胞瘤的新方向。 CCR5 是G 蛋白偶聯(lián)因子超家族成員（GPCR）的細胞膜蛋白，作為編碼C-C 趨化因子配體5（CCL5）的受體之一，可促進基質(zhì)的形成和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[12]。 CCL5/CCR5 通過PI3K/AKT 通路、絲裂原活化蛋白激酶和ERK 作用，進而激活細胞核因子-κB，導致αvβ3 整合素活化，促進細胞遷移[13-15]。 CCL5/CCR5是胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和腎癌等多種癌癥預后不良的生物標志物[16]。 CCL4 也稱為巨噬細胞炎性蛋白1β（MIP-1β），屬于促炎性C-C 亞家族。 有研究發(fā)現(xiàn)，在RWPE-1 細胞中CCL4 誘導的EMT 可能是前列腺癌發(fā)生中涉及的一個新的重要過程[17]。 另外，還有研究表明精原細胞瘤中淋巴細胞浸潤的程度與疾病復發(fā)的風險降低有關[18]。 因此，CCL4 有可能成為精原細胞瘤的一種新的診斷和免疫治療因子。 然而，有關信號和細胞間相互作用的細節(jié)還需要進一步研究。 有研究表明，CCL19 和CCR7 在許多惡性腫瘤中都存在過表達現(xiàn)象，證明CCL19 和CCR7 的過表達與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關[19,20]。 其中有研究指出前列腺癌組織中CCL19 以及CCR7 在mRNA 水平及蛋白的表達水平較高，而良性前列腺增生組織中這些表達水平較低，可見CCR19/CCR7 通路在人前列腺癌侵襲性行為過程中可能起重要作用[21]。

綜上所述， 我們相信對這些hub 基因進行進一步的研究， 對精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展機制將會有更深入的認識。

本研究致力于分析、 確定精原細胞瘤發(fā)生的關鍵基因， 共發(fā)現(xiàn)1142 個差異基因和10 個hub 基因可能參與調(diào)控精原細胞瘤發(fā)生、發(fā)展，但是，仍需要進一步的研究來闡明這些基因、生物學功能。