P2X7 受體蛋白表達對胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展的影響

尚偉偉，司華，李金旭，王紅雷，孫慶章

（南陽市第二人民醫(yī)院1.肝膽外科；2.護理部，河南 南陽473000）

流行病學研究顯示,胰腺癌的發(fā)病率可達223~455/10 萬人左右[1]。 在合并有消化系統(tǒng)疾病特別是膽道系統(tǒng)疾病的人群中,胰腺癌的發(fā)病率可進一步上升。 現(xiàn)階段臨床上對于胰腺癌的病因研究顯示，細胞生物學因子的改變或者基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達調(diào)控水平等的改變，能夠影響癌細胞浸潤能力、侵襲能力，提升癌細胞的擴散風險，進而促進惡性腫瘤的早期發(fā)生及臨床預后的惡化。 P2X7 受體是重要的嘌呤類受體家族成員,其表達濃度的上升能夠通過誘導癌細胞腫瘤信號通路的激活,促進癌細胞細胞周期調(diào)控的異常,增加胰腺導管上皮細胞分化障礙、DNA 異常擴增等風險的提升[2,3]。 部分研究揭示了P2X7 受體在胰腺惡性腫瘤中的異常表達情況,發(fā)現(xiàn)高表達的P2X7 受體與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[4]，但缺乏對于P2X7 受體與患者臨床分期、組織學分型等臨床病理特征的關(guān)系研究。 為了進一步揭示P2X7 受體的表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系,從而為臨床上胰腺癌的預后評估提供可靠的參考指標,本次研究選取本院病理科收集的手術(shù)后胰腺癌組織80 例,探討了P2X7 受體蛋白的表達及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院病理科收集的手術(shù)后胰腺癌組織80 例為病例組、 既往病理科收集的20例正常胰腺組織石蠟塊為對照組, 收集時間2013年1 月-2017 年1 月。

病例組，男47 例、女33 例，年齡38～75 歲，平均59.6±13.0 歲,病灶部位：胰腺頭部66 例,胰腺體尾部14 例;腫瘤病灶直徑≥4cm 44 例,<4cm 36 例;UICC 分期標準：Ⅰ期18 例、Ⅱ期26 例、Ⅲ期36例；分化程度：高分化17 例、中分化21 例、低分化42 例。對照組，男12 例、女8 例，年齡27～75 歲，平均56.0±14.1 歲；隨訪12 個月死亡59 例，存活21例。 兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴患者年齡19～75 歲; ⑵對照組標本來源于既往外傷患者手術(shù)切除標本,經(jīng)手術(shù)后病理檢查均為正常胰腺組織;⑶胰腺癌患者在手術(shù)前未接受放化療；⑷胰腺癌患者術(shù)前經(jīng)CT、MRI 檢測診斷，術(shù)后經(jīng)病理學檢查證實；⑸兩組研究對象的基礎(chǔ)資料均完整。

1.2.2 排除標準 ⑴轉(zhuǎn)移性胰腺癌； ⑵未經(jīng)病理學檢查證實的胰腺組織；⑶資料不完整，難以納入統(tǒng)計分析。

1.3 免疫組化檢測方法 所有組織標本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復合體法 (strep avidin—biotin complex，SABC 法) 染色，二氨基聯(lián)苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。P2X7 受體蛋白抗體、PV6000 通用型二抗以及SP 試劑盒和DAB 顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。 以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對照,高倍顯微鏡下觀察相關(guān)蛋白的表達情況,具體染色步驟嚴格按照SP 試劑盒說明書進行操作。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷標準 免疫組化結(jié)果判定：P2X7 受體蛋白的陽性著色表達于細胞膜和細胞質(zhì)，呈黃色、棕黃色、褐色表達，⑴根據(jù)著色強度：0分為無色、1 分為淡黃色、2 分為棕黃色、3 分為褐色、黑色；⑵根據(jù)陽性細胞比例：陽性細胞數(shù)目所占比例≤10%為1 分、陽性細胞所占比例11%～50%為2 分、陽性細胞數(shù)51%～75%為3 分、陽性細胞數(shù)所占比例>75%為4 分，兩種積分相乘總分<3 分為陰性、≧3 分為陽性?？偡?3 分：“-”表達；為3～5分，“+”表達；為6～9 分，“++”表達；>9 分，“+++”表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS16.0，采用均數(shù)±標準差（x±s）進行統(tǒng)計描述，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料采用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗； 多因素分析采用Logistic 回歸分析法；P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胰腺組織標本中的P2X7 受體蛋白陽性表達率比較 病例組胰腺癌組織中的P2X7 受體蛋白陽性表達率66.25%顯著的高于對照組胰腺組織中的10.00%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,見表1，圖1。

表1 兩組胰腺組織標本中的P2X7 受體蛋白陽性表達率比較

2.2 P2X7 受體蛋白陽性表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 UICC 分期（Ⅲ期）胰腺癌組織的P2X7受體蛋白陽性表達率、低分化程度的P2X7 受體蛋白陽性表達率、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的P2X7 受體蛋白陽性表達率均分別顯著的高于UICC 分期（Ⅰ期+Ⅱ期）、高+中分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；胰腺癌組織的P2X7 受體蛋白陽性表達率表達與患者的年齡、性別、病灶部位、病灶直徑無關(guān)（P>0.05）,見表2。

圖1 A 為胰腺癌組織中P2X7 受體蛋白陽性表達，B 為正常胰腺組織中P2X7 受體蛋白陰性表達（SP×200 倍）

表2 P2X7 受體蛋白陽性表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 P2X7 受體蛋白表達與胰腺癌患者預后關(guān)系的多因素分析 經(jīng)Logistic 回歸分析，UICC 分期為Ⅲ期、組織學低分化、P2X7 受體蛋白陽性表達是胰腺癌患者12 個月隨訪不良結(jié)局的獨立危險因素（P<0.05）,見表3。

3 討論

胰腺癌的發(fā)病病因較為復雜,一般認為基因水平或者激素水平的波動可能是促進胰腺癌發(fā)生的主要因素。 已經(jīng)公認的激素的敏感性的改變，特別是胰腺上皮細胞膜上激素受體的上調(diào),能夠顯著促進惡性腫瘤的發(fā)生。近年來,越來越多的研究顯示，基因調(diào)控或者分子生物學水平的改變,是促進胰腺癌發(fā)生的又一重要因素。 分子譜相關(guān)水平的波動，能夠影響癌細胞的生物學特征、增強癌細胞細胞周期的調(diào)控，促進免疫逃逸、抑制機體的T 淋巴細胞免疫反應(yīng)等，進而協(xié)助腫瘤的浸潤或者轉(zhuǎn)移[5,6]。 本次研究對于P2X7 受體蛋白的表達分析研究，能夠為臨床上胰腺癌患者的術(shù)后隨訪、術(shù)前病情評估等提供潛在的參考指標。

表3 P2X7 受體蛋白表達與胰腺癌患者預后關(guān)系的多因素分析

P2X7 受體蛋白是重要的過氧化酶抗過氧化酶相關(guān)因子，能夠促進體內(nèi)的氧化反應(yīng)的激活，提高患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng),增加不同的細胞炎癥因子對于胰腺上皮細胞的浸潤，誘導低氧環(huán)境，增加癌細胞持續(xù)性DNA 分裂的風險。 P2X7 受體蛋白在甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤病灶組織中存在一定程度的異常表達,其蛋白結(jié)構(gòu)上包含的多個可結(jié)合的巰基結(jié)構(gòu),能夠促進患者體內(nèi)的癌細胞膜表面的糖蛋白的激活, 增加癌細胞內(nèi)的腫瘤相關(guān)信號通路如AKT 等的上調(diào),增加癌細胞分化凋亡障礙[7,8]。另外，P2X7 受體對于嘌呤類受體或者含巰基類受體的激活作用，能夠促進癌細胞生物學特征、腫瘤病灶組織學特征等的變化，影響到腫瘤的病情進展[9]。

本次研究通過免疫組化分析研究發(fā)現(xiàn),在胰腺癌病灶組織中P2X7 受體蛋白的表達濃度明顯上升，高于正常胰腺組織，差異具有統(tǒng)計學意義，提示P2X7 受體蛋白可能參與了胰腺癌的病情進展過程中，P2X7 受體蛋白的高表達能夠通過影響到癌細胞的分化、促進癌細胞增殖速度的改變、加劇癌細胞的細胞周期調(diào)控障礙等,進而導致患者臨床病情的進展、臨床預后的惡化[10-12]：⑴P2X7 受體蛋白對于胰腺導管上皮細胞內(nèi)NOTCH 蛋白的上調(diào)作用，能夠促進癌細胞粘附能力的下降，促進癌細胞的轉(zhuǎn)移； ⑵P2X7 受體蛋白對于癌細胞免疫逃逸的促進作用, 能夠?qū)е掳┘毎用揅D4+T 淋巴細胞的殺傷作用。Giannuzzo A 等[13,14]研究者在探討了部分胰腺癌患者的臨床病理特征后發(fā)現(xiàn)，P2X7 受體蛋白的平均陽性表達率可上升25%以上， 而患者的治療敏感性越差、 治療后的臨床轉(zhuǎn)歸越差，P2X7 受體蛋白表達陽性率上升越為明顯。 免疫組化染色分析可見，P2X7 受體蛋白主要定位于胰腺上皮細胞質(zhì)內(nèi)及細胞間質(zhì)成分中,特別是在細胞核周邊的富集分為明顯，提示P2X7 受體蛋白可能作用通過影響到細胞內(nèi)信號通路的調(diào)控異常,進而促進胰腺癌的發(fā)生。 在不同的腫瘤病灶直徑或者胰腺不同部位的腫瘤中，P2X7 受體蛋白的表達并無顯著的差異，而在發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期較晚或者細胞分化程度較差的人群中，P2X7 受體蛋白的表達陽性率較高，一方面提示P2X7 受體蛋白與胰腺癌患者的臨床病理特征密切相關(guān),另一方面考慮P2X7 受體蛋白主要可能影響到癌細胞對于淋巴結(jié)內(nèi)皮粘附因子adherin 1 的表達, 促進癌細胞對于臨近正常胰腺組織的浸潤,促進臨床分期等的進展。但部分研究者并未發(fā)現(xiàn)P2X7 受體蛋白的表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[15],考慮樣本量收集、檢測方法或者放化療的應(yīng)用影響到了P2X7 受體的表達陽性率。 危險因素分析可見，UICC 分期為Ⅲ期、 組織學低分化、P2X7 受體蛋白陽性表達，是胰腺癌患者12 個月隨訪不良結(jié)局的獨立危險因素，進一步提示了P2X7 受體蛋白對于胰腺癌患者臨床結(jié)局的影響。

綜上所述，腺癌癌組織中P2X7 受體蛋白表達上調(diào)，并且與UICC 分期、腫瘤分化及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。