一起金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件溯源調(diào)查

游興勇，周厚德，蔡軍，劉洋，劉成偉

（1.江西省疾病預(yù)防控制中心 江西省食源性疾病診斷溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330029；2.南昌市東湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌330000）

金黃色葡萄球菌是食物中毒事件的常見病原菌，其產(chǎn)生的腸毒素污染食品，能引起惡心、嘔吐、腹痛等急性胃腸炎癥狀[1]。 金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已經(jīng)成為全球關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。 2017 年9 月21 日，某市發(fā)生一起較為嚴(yán)重的兒童食物中毒事件，通過實(shí)驗(yàn)室分子溯源檢測(cè)，最后確定為是一起以分泌SEA 型和SED 型腸毒素的兩種金黃色葡萄球菌污染草莓卷引起的食物中毒事件。 報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本次調(diào)查一共采集樣品43 份，其中病人生物標(biāo)本12 份，食品樣品標(biāo)本為25 份，企業(yè)環(huán)境樣本6 份。

1.1.2 試劑耗材 選擇性培養(yǎng)基（青島海博），沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、致瀉大腸埃希氏菌和弧菌的顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉），腸毒素分型檢測(cè)試劑盒（北京良潤生物），腸毒素?zé)晒舛縋CR 試劑盒（深圳生科源），限制性內(nèi)切酶XbaI 和SmaI（日本TakaRa），蛋白酶K（美國Merck），葡萄球菌溶菌素（美國Sigma），Gel-red（美國Biotium）。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR 儀、脈沖場(chǎng)凝膠電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad）、比濁儀（法國Vitek）、全自動(dòng)酶聯(lián)免疫儀（美國Molecular Devices）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本檢測(cè) 參照2017 版《國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)手冊(cè)》,對(duì)采集的食品樣品開展沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸埃希氏菌、單核增生李斯特氏菌等致病菌的檢測(cè)。 環(huán)境樣本、 糞便標(biāo)本檢驗(yàn)參照2017 版《國家食源性疾病監(jiān)測(cè)手冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.2.2 腸毒素檢測(cè) 按照金黃色葡萄球菌腸毒素ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書，對(duì)分離菌株進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用ELISA 方法進(jìn)行SEA-SEF 腸毒素檢測(cè)試驗(yàn)。 PCR 檢測(cè)上，采用DNA 提取試劑盒，沸水浴方法提取金黃色葡萄球菌DNA, 參照試劑盒說明書構(gòu)建SEA-SEE 熒光定量PCR 體系，對(duì)分離株進(jìn)行腸毒素基因進(jìn)行分型。

1.2.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型 參照國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心TratNet 標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，用葡萄球菌溶菌素、裂解液使細(xì)胞在膠塊中原位裂解，將膠塊洗滌后的用SmaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后的膠條按照標(biāo)準(zhǔn)操作要求灌膠后進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。

電泳條件： 45kb 低分子量，450kb 高分子量，電泳溫度14℃，時(shí)間19h，其它為默認(rèn)設(shè)置。電泳結(jié)束后,將凝膠取出，用0.1 μg/ml 的Gel-red 染色并脫色。電泳的DNA 圖譜用BN7.6 軟件分析，以SmaⅠ酶切的H9812 進(jìn)行校準(zhǔn)。 通過采用Dice 系數(shù)并用非加權(quán)組平均法(UPGMA)(Bionumerics 7.6 美國)分析后輸出樹狀圖譜[2]。

2 結(jié)果

2.1 流行情況 2017 年9 月5 日下午六點(diǎn)半開始，某市鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生所陸續(xù)收到7 名劇烈嘔吐的就診病例，直接轉(zhuǎn)入省兒童醫(yī)院，同一時(shí)間有另外兩家幼兒園的小朋友在省兒童醫(yī)院救治, 三家幼兒園共120 名左右的患者，全部病例癥狀相似，以嘔吐、腹瀉為主的急性胃腸炎表現(xiàn)。 截止9 月13 日，所有病例全部出院，無繼發(fā)病例和危重病例出現(xiàn)。 三家幼兒園共同的食物“草莓卷”均為同一食品公司生產(chǎn)。

2.2 檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 金黃色葡萄球菌分離與鑒定 本起事件采集的食品、糞便、廚師加工用刀具、砧板、廚房臺(tái)面等環(huán)境樣本進(jìn)行增菌、劃線接種后，除Baird-Parker平板顯示有金黃色葡萄球菌可疑菌落外,其余培養(yǎng)基上均無可疑菌落生長。 將金黃色葡萄球菌分離在科瑪嘉顯色平板上,檢出16 株金黃色葡萄球菌，其中病人生物標(biāo)本4 份，食品樣品標(biāo)本為7 份，企業(yè)環(huán)境樣本5 份。 將16 株分離菌進(jìn)行兔血漿凝固酶、血平板溶血、乳膠凝集生化試驗(yàn)，結(jié)果均為陽性。

2.2.2 腸毒素檢測(cè)和分型 ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書結(jié)果顯示，16 株分離株均呈現(xiàn)腸毒素陽性，其中14 株為SEA，2 株為SED 腸毒素，具體為4 份病人樣本中共檢出腸毒素3 份SEA 和1 份SED，7 份食品樣本基本均來自草莓卷食品，7 份食品樣本和5 份企業(yè)環(huán)境樣本的12 株分離株共檢出腸毒素11 份SEA 和1 份SED，熒光定量PCR 試劑盒方法基因檢測(cè)結(jié)果也顯示與ELISA 表型一樣的結(jié)果。

2.2.3 PFGE 結(jié)果 16 株產(chǎn)毒株經(jīng)SmaI 酶切后進(jìn)行PFGE，16 株菌除10 株成功分型外，有6 株因降解和DNA 濃度低等原因未能成功分型。 聚類分析以相似度為80%視為同一類菌株,結(jié)果顯示分泌腸毒素SED 的病人菌株和食品菌株為一類, 其余分泌腸毒素SEA 的菌株為一類, 提示污染可能來自兩種不同的金黃色葡萄球菌克隆株。

圖1 金黃色葡萄球菌腸毒素?zé)晒舛縋CR 結(jié)果

圖2 PFGE 經(jīng)SmaI 酶切后的分子分型圖譜

3 討論

金黃色葡萄球菌是近年來社區(qū)和醫(yī)院感染的重要危險(xiǎn)致病菌之一，其致病性強(qiáng)，感染速率高，傳播度快，耐藥性強(qiáng)，為疾病治療帶來了極大困難[3]。 謝筱莉等[4]對(duì)本地院內(nèi)分離的金黃色葡萄球菌的相關(guān)研究表明,金黃色葡萄球菌耐藥性仍是臨床重要問題尤其是MRSA 的檢出率高于國內(nèi)其他地區(qū)。

目前已報(bào)道的金黃色葡萄球菌腸毒素種類有10 種[5]，其中A 型毒力最強(qiáng)，其引起的食物中毒也最多[6]。 市售食品中金黃色葡萄球菌均有檢出，國譯丹等[7]報(bào)道的云南省食品中金黃色葡萄球菌總檢出率為2.85%，其中肉與肉制品、餐飲食品污染嚴(yán)重。 隨著網(wǎng)絡(luò)外賣食品的興起，近年來金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時(shí)有發(fā)生，2016 年河北省石家莊市某高校多名學(xué)生因食用網(wǎng)購食品引起金黃色葡萄球菌食物中毒[8]。2017 年浙江省寧?？h某學(xué)校因外賣集中配送餐污染金黃色葡萄球菌引起29 人食物中毒[9]。

本次事件中共有140 名幼兒中毒,涉及3 家幼兒園，通過流行病學(xué)調(diào)查和臨床癥狀等分析，初步判定為金黃色葡萄球菌引起的食物中毒。 從病人、食品及生產(chǎn)企業(yè)環(huán)境中共采集了43 份樣本， 共分離了16 株金黃色葡萄球菌，均經(jīng)過生化等方法鑒定確認(rèn)。 未分離到其它致病菌。 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測(cè)是確定金黃色葡萄球菌食物中毒的重要依據(jù)， 目前主要采用ELISA、 熒光定量PCR、 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法，其中實(shí)時(shí)熒光PCR 方法以其靈敏度較高、檢測(cè)快速的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為首選的方法[1]。 本實(shí)驗(yàn)共分出14 株分泌A 型腸毒素和2 株分泌D 型腸毒素的金黃色葡萄球菌。 10 株P(guān)FGE 成功分型的金黃色葡萄球菌顯示為來源于2 種不同的金黃色葡萄球菌克隆株。 綜合流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，可以判定本次事件是由SEA、SED 型的兩種金黃色葡萄球菌污染草莓卷引起的一起食物中毒事件。

金黃色葡萄球菌在自然界廣泛分布,從食品原材料、生產(chǎn)加工、流通經(jīng)營到最后食用都有污染的可能。 本次事件調(diào)查結(jié)果證實(shí)為一起因金黃色葡萄球菌污染原材料后未進(jìn)行有效的消毒,造成生產(chǎn)加工過程中的二次污染而導(dǎo)致了食物中毒。 因此，生產(chǎn)者應(yīng)加強(qiáng)食品生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)的監(jiān)督檢查，重點(diǎn)落實(shí)好原材料、加工過程的消毒和滅菌，最大限度地保障該類食品的食用安全， 降低食物中毒的風(fēng)險(xiǎn)。