檢測HLA-B27+/B7- 在診斷強直性脊柱炎中的臨床價值

董玉蘭，徐冉，余志宏，馬亮

（景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院檢驗科，江西 景德鎮(zhèn)333000）

強直性脊柱炎 （Ankylosing spondylitis，AS）是脊柱關(guān)節(jié)炎（Spondyloarthritis，SpA）常見的臨床類型，以中軸關(guān)節(jié)受累為主，可伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強直， 影響患者生存質(zhì)量。多見于青壯年男性，20～30 歲發(fā)病較多。多數(shù)患者進(jìn)展緩慢、病情隱匿，往往不能引起人們的重視。 該疾病的主要診斷依據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)檢查，但在疾病早期骨骼未發(fā)生改變，影像學(xué)特征不是很明顯如X 線還只是出現(xiàn)Ⅰ級或Ⅱ級改變，臨床癥狀又與其他疾病非常相似難以區(qū)分， 因此容易發(fā)生漏診和誤診。國內(nèi)的流行病學(xué)表明，我國AS的發(fā)病率為0.2%～0.45%[1]，而臨床上約90%的AS患者HLA-B27+/B7-陽性[1]。 因此，HLA-B27+/B7-的檢測在該病的診斷和鑒別診斷中具有重要價值。流式細(xì)胞儀使用熒光素和單克隆抗體,可多參數(shù)同時測定，具有高靈敏度、特異性，并用計算機進(jìn)行光信號的數(shù)據(jù)處理分析,提高了檢測速度與統(tǒng)計分析的精確性,實現(xiàn)了單細(xì)胞的高效、特異性分析。標(biāo)本之間、不同實驗室之間重復(fù)性好,被廣泛應(yīng)用于人類白細(xì)胞抗原B27 的檢測。 本研究旨在用流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA-B27+/B7-的表達(dá),以及其在AS 診斷和鑒別診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年6 月至2018 年1 月景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院門診和住院AS 患者(AS組)82 例，其中男70 例，女12 例，年齡10～75 歲，平均34.6 歲；腰椎間盤突出癥（lumbar intervertebral disc herniation，LDH）患者（LDH 組）50 例，其中男19 例，女31 例，年齡29～78 歲，平均52.8 歲；健康體檢者（正常對照組）40 例,其中男34 例，女6例，年齡15～72 歲，平均35.8 歲，均為該院體檢中心健康體檢者。 所有患者均符合指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)相關(guān)科室醫(yī)生確認(rèn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有AS 患者均符合2010 年中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會強直性脊柱炎診斷及治療指南[2]的標(biāo)準(zhǔn)。所有腰椎間盤突出癥患者均符合2015年安徽省腰椎間盤突出癥分級診療指南[3]的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴診斷明確， 病歷資料完善者；⑵健康體檢者心、肝、肺、腎、眼等功能基本正常。 ⑶研究對象簽署知情同意書并積極配合檢查。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 符合下列條件之一者即排除：⑴臨床資料不全者；⑵妊娠或哺乳期婦女；⑶合并有其他疾病引起的精神及行為異常者;⑷不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者。

1.5 儀器與試劑 儀器采用美國貝克曼公司的Beckman-Coulter FC500 流式細(xì)胞儀, 單克隆抗體HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE、IgG2a-FITC/IgG1-PE、 溶血素、 鞘液均來自貝克曼公司的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。

1.6 方法 清晨空腹采集EDTA-K2 抗凝靜脈血2ml，取2 支流式專用管，做好標(biāo)記，一支為同型對照管，另一支為測定管，向兩管各加入全血50μl，然后向同型對照管加入IgG2a-FITC/IgG1-PE 試劑10μl，測定管加入HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 試劑10μl， 振蕩混勻后室溫避光孵育15～20min，然后依次向各管中加入溶血素500μl，混勻后室溫避光孵育10min， 待完全溶血后500×g 離心5min,棄上清。加入500μl PBS 洗滌一次，500×g 離心5min，棄上清。 加500μl 含1%多聚甲醛的PBS 懸浮細(xì)胞，混勻后上機檢測或置于4～8℃冰箱待測。

1.7 質(zhì)量控制 實驗前進(jìn)行光路、流路的校正和熒光補償，設(shè)置陰性對照管。 用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料用百分率表示,組間比較采用χ2檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取數(shù)據(jù) 采用流式細(xì)胞儀自帶的軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。 如圖1 所示，先通過FS-SS 雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門,區(qū)分經(jīng)溶血素裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、 單核細(xì)胞和粒細(xì)胞三個群體。 獲取5000 個淋巴細(xì)胞，然后再分析5000 個淋巴細(xì)胞中HLA-B27+/HLA-B7-細(xì)胞群的百分比和熒光強度見圖2，如果大于或等于儀器設(shè)定的界值報告陽性，否則報告陰性。

圖1 通過FS Lin/SS Lin 雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門

圖2 淋巴細(xì)胞中HLA-B27+/B7- 細(xì)胞群的熒光強度和百分比

2.2 AS 患者的年齡及性別分布情況 AS 患者中男性多于女性，男女比例為5.8:1，其中以青壯年男性（<40 歲）的發(fā)病率最高，占61.0%，見表1。

表1 AS 患者的年齡及性別分布情況[n(%)]

2.3 HLA-B27+/B7-陽性率比較 AS 組HLA-B27+/B7-的陽性率為89.0%(73/82),顯著高于LDH 組（P<0.01）和正常對照組的陽性率（P<0.01）。 而對照組與LDH 組之間的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05），見表2。

表2 AS 患者、LDH 患者與健康體檢者HLA-B27+/B7- 的陽性率比較

2.4 采用流式細(xì)胞儀檢測HLA-B2 7+/B7-的各項臨床評價指標(biāo) HLA-B27+/B7-檢測對診斷AS 的靈敏度為89.0%( 73/82) ,特異度為95.0%( 38/40)，陽性預(yù)測值為97.3%（73/75）， 陰性預(yù)測值為80.9%（38/47），陽性似然比為17.8，陰性似然比為0.1，見表3。

表3 各項臨床評價指標(biāo)結(jié)果

3 討論

HLA-B27 作為免疫遺傳標(biāo)記抗原, 幾乎表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面上，特別是淋巴細(xì)胞表面，在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識別,誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 HLA-B27 分子可以和一些自身肽段結(jié)合,形成復(fù)合體在自身細(xì)胞膜上表達(dá)后，能被相應(yīng)的CD8+T 細(xì)胞識別，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞對自身靶細(xì)胞的殺傷，造成組織變性、器官受損[4]。本研究中對82 例確診AS 患者用FCM 進(jìn)行HLAB27+/B7-檢測分析后發(fā)現(xiàn), 受檢者中男女之比為5.8:1(70/12)，且小于40 歲男性占61.0%，說明AS主要在青壯年男性發(fā)病率高,這與流行病學(xué)資料相一致，也有認(rèn)為可能是女性患者病情相對更緩和，臨床醫(yī)生對女性患者的認(rèn)識不足,還有研究認(rèn)為女性在HLA-B27 陰性的AS 患者中顯示出更高的比例[5]。 本研究發(fā)現(xiàn)有一對AS 患者父女HLA-B27+/B7-檢測都為陽性, 另有一例患者明確有強直性脊柱炎家族病史, 提示本病發(fā)病機制可能與遺傳有關(guān)。 又有研究表明大約10%HLA-B27 陽性AS 患者的一級親屬將來會發(fā)展為AS[6]，并且HLA-B27陽性AS 患者其發(fā)病年齡早、癥狀重，預(yù)后及轉(zhuǎn)歸均較差[7]，因此臨床上有必要對HLA-B27 陽性的一級親屬開展HLA-B27+/B7-的檢測。 根據(jù)最近的研究表明,TREML2（表達(dá)在骨髓細(xì)胞激發(fā)受體家族成員之一） 基因的突變是一個導(dǎo)致散發(fā)和家族中HLA-B27 陽性AS 病人的主要因素。 更者，TREML2 可能會作為AS 的一個易感基因。 這些發(fā)現(xiàn)提供了一個更好地理解AS 發(fā)病的分子機制和新的治療靶點[5]。

本研究中HLA-B27+/B7-檢測對診斷AS 的靈敏度為89.0%( 73/82),特異度95.0%( 38/40) 。 陽性預(yù)測值為97.3%（73/75）,陰性預(yù)測值為80.9%（38/47），陽性似然比為17.8，陰性似然比為0.1。 顯示AS 與HLA-B27+/B7-成正相關(guān)。 值得注意的是，82例確診為AS 患者有9 例為HLA-B27+/B7-結(jié)果陰性,同樣的,50 例LDH 患者有3 例HLA-B27+/B7-結(jié)果陽性以及40 例健康體檢者也有2 例HLA-B27+/B7-結(jié)果陽性，因此AS 的診斷必須結(jié)合臨床癥狀、X 線及其他檢查綜合做出分析。 雖然根據(jù)1984 年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)HLA-B27 陽性不能作為AS 的診斷依據(jù)，但隨著人們對疾病的不斷認(rèn)識，2009 年及2011 年國際脊柱關(guān)節(jié)炎專家評估協(xié)會（ASAS），先后提出了中軸型和外周型SpA 新的脊柱關(guān)節(jié)炎分類，尤其是更加強調(diào)了HLA-B27 陽性對診斷中軸型SpA 的重要性[7]，將HLA-B27 陽性納入診斷中軸型SpA 的指標(biāo)之一。 基于這種情況，若患者臨床上有腰骶髂關(guān)節(jié)部疼痛癥狀，X 線檢查陰性，而HLA-B27 檢測陽性, 應(yīng)高度警惕處于強直性脊柱炎發(fā)病早期。

臨床上AS 表現(xiàn)復(fù)雜多樣，患者第一次就診時最容易被誤診為腰椎間盤突出癥[8],這是臨床上比較多見的需要對這兩種疾病進(jìn)行鑒別。 雖然炎性腰背痛是AS 病變過程中的典型臨床特征，但并非所有AS 患者的首發(fā)癥狀。 炎性背痛滯后的出現(xiàn)加上早期X 線的不典型表現(xiàn)以及現(xiàn)代生活方式的改變使得很多AS 患者就診時被誤診為腰椎間盤突出癥引起。 根據(jù)馬驍?shù)葟娭毙约怪渍`診情況分析，易誤診的前五種疾病為腰椎間盤突出、腰肌勞損、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]。本次研究中AS 患者陽性率為89.0%,而50 例LDH患者,只有3 例HLA-B27+/B7-陽性,陽性率為6.0%,兩組患者陽性率具有顯著差異（P<0.01）；另外根據(jù)林蔚等的研究發(fā)現(xiàn)AS 患者HLA-B27 陽性率為85.7%，高于RA 患者（P<0.05）[4]，也說明了HLAB27 檢測可以作為鑒別相關(guān)疾病的一項重要指標(biāo)。AS 關(guān)節(jié)外表現(xiàn)可累及眼部、 腸道和腎臟等多系統(tǒng)[9]。本次研究有四例確診AS 患者來自眼科，并都是單眼并發(fā)葡萄膜炎（虹膜睫狀體炎），且均為男性。HLA-B27 陽性與葡萄膜炎有著密切的關(guān)系已得到明確證實[10,11]。 由于AS 患者的眼部癥狀容易復(fù)發(fā)，且可導(dǎo)致患者致盲等嚴(yán)重后果,因此對于眼部疾病癥狀先于關(guān)節(jié)病變癥狀出現(xiàn)的患者, 在臨床診斷中，HLA-B27 應(yīng)作為一項排除強直性脊柱炎的篩查指標(biāo),以便早期發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎并針對性地對患者進(jìn)行治療，具有重大的臨床意義[12]。

流式細(xì)胞術(shù)法所用的單克隆抗體在檢測HLA-B27 時會與其它HLA 抗原 （特別是HLAB7）發(fā)生交叉反應(yīng)，對檢測結(jié)果造成影響。 目前，國內(nèi)常用的Beckman-Coulter 有商品化的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 雙標(biāo)單克隆抗體試劑，本研究使用這種方法對HLA-B27/B7 進(jìn)行分析,同時分析熒光陽性百分率和平均熒光強度,可以大幅度提高檢測靈敏度和特異性,減少HLA-B7 交叉反應(yīng)可能會引起的HLA-B27 假陽性[1]。 同時FCM 抗原檢測方便快捷，操作簡單，能夠快速檢測大量細(xì)胞,極大地節(jié)約了分析時間，是臨床篩查AS 的理想方法。 雖然也有研究采用PCR-SBT 分型方法對AS 患者及健康對照人群檢測HLA-B27 基因主要致病亞型及可能的保護(hù)亞型,對于癥狀體征不典型患者和疑難患者的診斷和鑒別診斷具有一定價值[13]，尤其是對處于臨界值抗原弱表達(dá)的判斷可提高檢測的準(zhǔn)確性。 但PCR 方法對操作人員和實驗條件的要求比較高,因此目前國際上普遍采用流式細(xì)胞術(shù)檢測人類白細(xì)胞抗原B27。

綜上所述, 用流式細(xì)胞術(shù)來檢測HLA-B27+/B 7-的表達(dá),其靈敏度和特異性具有較高的臨床適用性，結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)檢查，不僅可以提高診斷AS 的準(zhǔn)確性, 還可以作為早期診斷AS 和鑒別診斷的指標(biāo)，讓更多的患者得到早期診斷，盡早進(jìn)行預(yù)防或及時治療。 對于臨床高度疑似AS 而HLA-B27+/B7-檢測陰性的患者，應(yīng)加強長期隨訪，以減少漏診和誤診。