HSP 患兒外周血中T 細(xì)胞變化、血清GdIgA1、NF-κB的變化及其意義

劉新學(xué)，王高鋒，時(shí)娟

（新蔡縣婦幼保健院兒科，河南 駐馬店463500）

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2015 年8 月-2018 年7 月于新蔡縣婦幼保健院確診的HSP 患兒66 例為HSP 組、選取同期進(jìn)行體檢的健康兒童60 例作為對(duì)照組。HSP 組,男41 例、女25 例；年齡3~14 歲,平均8.7±2.6 歲；平均體重31.2±3.2kg，依據(jù)2010 年歐洲兒科風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)： 普通型26 例、腹型28 例、紫癜性腎炎患兒12 例。對(duì)照組,男38 例、女22 例；年齡3~14 歲，平均8.5±2.0 歲；平均體重32.0±3.7kg。 兩組兒童的年齡、性別、體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)：HSP 患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2010 年歐洲兒科風(fēng)濕病協(xié)會(huì)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡3～14 歲；⑵均為初診患兒，且入院時(shí)處于急性期。 ⑶對(duì)照組兒童來(lái)源體檢中心，體檢結(jié)果均為健康；⑷本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后實(shí)施。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴惡性腫瘤；⑵其他類(lèi)型風(fēng)濕、免疫學(xué)疾??；⑶先心病；⑷既往具有糖皮質(zhì)激素治療史；⑸合并其他系統(tǒng)的重大疾病。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 法測(cè)定NF-κB、Gd-IgA1 清晨抽取外周空腹靜脈血3ml，靜置20min，3000 r/min 離心10min 后保留血清并置于-80℃冰箱中待測(cè)。 試劑盒均由美國(guó)TSZ 公司提供， 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tfh、Tfr 細(xì)胞水平 在進(jìn)行治療前抽取外周靜脈血4ml,放入含EDTA 的試管中, 使用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。 將PB MC 懸液分裝成兩個(gè)試管, 兩管都加入10μl 的CD 4-FITC、CXCR5-APC 和ICOS-PECy5 單克隆抗體（美國(guó)eBioscience 公司產(chǎn)品），避光孵育0.5h，再將500μl 的紅細(xì)胞裂解液加入試管內(nèi)。 其中1 管PBMC 懸液用PBS 洗滌, 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tfh細(xì)胞表達(dá)情況； 另1 管經(jīng)PBS 洗滌離心后則加入Foxp3-PE（美國(guó)eBioscience 公司產(chǎn)品），避光孵育15 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tfr 細(xì)胞表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中所有數(shù)據(jù)的分析均采用SPSS21.0 版本, 年齡、Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平等計(jì)量指標(biāo)采用x±s 表示,數(shù)據(jù)對(duì)比分析應(yīng)用t 檢驗(yàn)或方差分析法，方差分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果采用LSD-t 檢驗(yàn)； 采用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩組性別進(jìn)行構(gòu)成比較；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二組Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較 HSP 組的Tfh 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較高于對(duì)照組（P<0.05），HSP 組的Tfr 細(xì)胞低于對(duì)照組（P<0.05）,見(jiàn)表1。

表1 二組Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較（x±s）

2.2 急性期與緩解期HSP 組患兒的Tfh 細(xì)胞、Tfr細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較 急性期HSP 組患兒Tfh 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較高于緩解期（P<0.05），急性期HSP 的Tfr 細(xì)胞低于緩解期（P<0.05）,見(jiàn)表2。

2.3 不同臨床分型的HSP 組患兒Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較 急性期，紫癜性腎炎患兒Tfh 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較高于普通型、腹型組（P<0.05）,紫癜性腎炎患兒Tfr 細(xì)胞低于普通型、腹型組（P<0.05）；腹型患兒Tfh 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較高于普通型（P<0.05），腹型組患兒Tfr 細(xì)胞低于普通型（P<0.05）。 見(jiàn)表3。

表2 急性期與緩解期HSP 組患兒的Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較（x±s）

表3 不同臨床分型的HSP 組患兒Tfh 細(xì)胞、Tfr 細(xì)胞、GdIgA1、NF-κB 水平比較（x±s）

3 討論

HSP 可侵襲全身多個(gè)系統(tǒng),常以皮膚、關(guān)節(jié)、消化道和腎臟受累為主，重者也可出現(xiàn)心、肺、腦及胰腺等的受累[7]，其具體發(fā)病機(jī)制仍需探討。

HSP 可看作為由Gd-IgA1 引發(fā)的免疫性血管炎, 異常Gd-IgA1 分子導(dǎo)致Gd-IgA1 聚集和形成大分子Gd-IgA1 復(fù)合物的傾向增加[8],此種Gd-Ig A1 在肝臟內(nèi)不能完全代謝而沉積在全身各大系統(tǒng)的中小血管內(nèi)，激活補(bǔ)體旁路途徑，觸發(fā)炎癥介質(zhì)釋放，引起中小血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。NF-κB 為調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子， 在Gd-IgA1 腎病中表達(dá)水平也較高[9]。 但他們之間是否有某種聯(lián)系共同導(dǎo)致HSP 的發(fā)生有待闡明。

Tfh 細(xì)胞是CD4+ T 細(xì)胞亞群中的一員, 可輔助B 淋巴細(xì)胞的分化, 還可使抗體類(lèi)型發(fā)生轉(zhuǎn)換。目前認(rèn)為自身反應(yīng)性B 細(xì)胞過(guò)度活化可能會(huì)使Gd-IgA1 抗體過(guò)度產(chǎn)生,而這是HSP 的重要發(fā)病機(jī)理[10,11]，但其中B 細(xì)胞過(guò)度活化的原因尚不完全明確。

本研究將HSP 患者作為觀(guān)察對(duì)象， 檢測(cè)其外周血中Tfh、Tfr 細(xì)胞、血清Gd-IgA1、NF-κB 水平，并根據(jù)患兒病情分為急性期、緩解期，急性期時(shí)不同臨床類(lèi)型進(jìn)行亞組分析,揭示HSP 患兒血清中T淋巴細(xì)胞、Gd-IgA1、NF-κB 的變化與病情變化的關(guān)系。 本研究發(fā)現(xiàn)：HSP 組的Tfh 細(xì)胞水平比較高于對(duì)照組,Tfr 細(xì)胞低于對(duì)照組；急性期HSP 組患兒Tfh 細(xì)胞高于緩解期，急性期HSP 的Tfr 細(xì)胞低于緩解期；急性期，紫癜性腎炎患兒Tfh 細(xì)胞水平比較高于普通型、腹型組，紫癜性腎炎患兒Tfr 細(xì)胞低于普通型、腹型組；腹型患兒Tfh 細(xì)胞水平比較高于普通型，腹型組患兒Tfr 細(xì)胞低于普通型。 提示Tfh 及Tfr 細(xì)胞異常表達(dá)可能參與了兒童HSP的發(fā)病過(guò)程。

本研究結(jié)果顯示：HSP 組的Gd-IgA1 水平顯著高于對(duì)照組，IgA1 免疫復(fù)合物在小血管壁和消化道和腎臟的沉積中引起炎癥和組織損傷,引發(fā)對(duì)HSP 異常的免疫炎癥反應(yīng)。 Gd-IgA1 的水平與HSP 疾病的活性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Gd-IgA1 可能是發(fā)生HSP 的起始因子之一。 本研究發(fā)現(xiàn)急性期Gd-IgA1 水平明顯高于緩解期,具有不同臨床表現(xiàn)的HSP 組中Gd-IgA1 水平不同。 急性期紫癜性腎炎組Gd-IgA1 水平高于普通組和腹部組。 腹部組高于普通組。 提示Gd-IgA1 可反映HSP 急性期活動(dòng)狀態(tài)， 高水平的Gd-IgA1 與HSP 臟器嚴(yán)重?fù)p傷如消化道粘膜出血壞死、腎臟損傷均密切相關(guān)，且Gd-IgA1 水平與腎臟損害的關(guān)系更加密切，有助于判斷HSP 的預(yù)后。

緩解期HSP 患者水平并未將至正常水平，可能是由于患兒早期腎臟損傷尚未痊愈。 有研究表明[12]，半乳糖基化缺失的水平?jīng)Q定著自身免疫反應(yīng)的程度， 而免疫復(fù)合物形成的量影響著HSP 的臨床表現(xiàn)。 Gd-IgA1 水平變化可預(yù)示HSP 的病情發(fā)展情況，對(duì)評(píng)估患者預(yù)后意義重大。

NF-κB 活化后可使IL-6、IL-8、TNF-α 等因子產(chǎn)生增加，加重細(xì)胞組織損傷程度。NF-κB 在血清及組織內(nèi)表達(dá)具有一致性[13,14]。 本研究通過(guò)對(duì)HSP患兒不同時(shí)期的NF-κB 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSP 患者的NF-κB 水平較對(duì)照組明顯升高，提示NF-κB 可能參與了HSP 的發(fā)生，但緩解期尚未降至正常水平，推測(cè)NF-κB 參與HSP 的小血管炎癥反應(yīng)，其活化水平與疾病的活動(dòng)狀態(tài)有關(guān)。 同時(shí)，腎損傷引起的HSP 患兒NF-κB 水平的恢復(fù)需要一定的時(shí)間，這可能與NF-κB 在調(diào)節(jié)抗炎基因表達(dá)和炎癥反應(yīng)中的作用有關(guān)。 腎小球病理?yè)p傷后細(xì)胞凋亡，不同臨床類(lèi)型的HSP 中NF-κB 水平不同。急性期HSP 組患兒NF-κB 水平高于緩解期，急性期，紫癜性腎炎患兒NF-κB 水平高于普通型、 腹型組, 腹型患兒NF-κB 水平高于普通型。這表明NF-κB 和HSP 與器官受累的情況和疾病嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性。有研究[15]表明腎臟損害和消化道出血患者血清中NF-κB 水平升高,當(dāng)腎小球處于炎性狀態(tài)時(shí)NF-κB 水平明顯升高，這可能是由于腎小球免疫活性細(xì) 胞 大 量 表 達(dá)NF-κB，NF-κB 活 化 程 度 越 高，TNF-α、IL-1B、IL-6 等細(xì)胞因子產(chǎn)生的越多，炎癥反應(yīng)越劇烈,小血管出血壞死及腎小球炎性損傷更加嚴(yán)重，患者的病情更為嚴(yán)重。

綜上所述，HSP 患兒存在典型的免疫失衡、炎性反應(yīng)，并且與患兒的病情嚴(yán)重程度、臨床分型情況有關(guān)。