人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離技術(shù)優(yōu)化及其快速檢測(cè)體系的建立

張?jiān)罎h，鐘志輝，黃林燕，劉宣瑜，邱振華

（高州市人民醫(yī)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)中心，廣東 高州525200）

間充質(zhì)干細(xì)胞主要是指一種源自中胚層，且具有自我更新以及多向分化潛能的成體肝細(xì)胞，廣泛存在于全身的器官間質(zhì)以及結(jié)締組織中，主要囊括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[1,2]。 其中UCMSC 具有來(lái)源豐富、獲取成本較低、不涉及論文問(wèn)題以及對(duì)捐獻(xiàn)者無(wú)損害等優(yōu)點(diǎn),可能是未來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于醫(yī)療中最具有潛力的理想選擇[3]。 目前，臨床上應(yīng)用于人UCMSC 分離培養(yǎng)的方式較多,且各有千秋，所獲得的細(xì)胞質(zhì)量存在明顯的差異[4]。由此可知,如何獲取相對(duì)可靠、安全以及優(yōu)質(zhì)的UCMSC 已成為細(xì)胞分離生產(chǎn)技術(shù)的重大問(wèn)題。 有研究報(bào)道顯示[5,6],間充質(zhì)干細(xì)胞作為一類(lèi)特殊的生物制劑藥物,于生產(chǎn)過(guò)程中必須保證生物學(xué)活性、分化能力以及增殖能力,同時(shí)需有效控制在此過(guò)程中外來(lái)微生物可能引起的感染。 鑒于此，本文通過(guò)研究人UCMSC 的分離技術(shù)優(yōu)化及其快速檢測(cè)體系的建立效果并予以分析。 旨在為尋找一套可快速、可靠、安全的檢測(cè)體系,繼而于最短時(shí)間內(nèi)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)施監(jiān)測(cè)，并回輸至宿主體內(nèi)，為人UCMSC 的分離以及檢測(cè)尋找一種更加優(yōu)化的手段，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臍帶來(lái)源 選取2018 年3 月-2018 年6 月于我院進(jìn)行分娩的20 例健康新生兒臍帶組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，將其以隨機(jī)抽簽法等分成2 份，即研究組與對(duì)照組。 納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴所有新生兒臍帶組織均于產(chǎn)婦及其家屬同意下，由我院婦產(chǎn)科采集，即待胎盤(pán)徹底脫離母體后,采用無(wú)菌生理鹽水完成臍帶的清洗，隨后對(duì)臍帶兩端予以結(jié)扎，每例臍帶采集長(zhǎng)度≥20cm；⑵新生兒均為足月分娩；⑶均為初產(chǎn)婦。 已獲得納入對(duì)象家屬同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 ⑴傳統(tǒng)貼壁法：將所獲取的臍帶進(jìn)行血管清除處理,隨后將其剪為0.5～0.8cm 的大塊，并接種在100mm 培養(yǎng)皿內(nèi), 保證臍帶切面向下貼壁,接種密度以25 塊為宜。 放置于培養(yǎng)箱中,于37℃，5%濃度的二氧化碳狀態(tài)下靜置5h，加入2ml 的培養(yǎng)液（主要為DMEM 培養(yǎng)液+10%FBS 培養(yǎng)液），并于24h 后再次加入10ml 的培養(yǎng)液。2d 后進(jìn)行半量換液處理,之后定期5d 進(jìn)行1 次全量換液，培養(yǎng)12d 后換液去除大部分的漂浮組織，待細(xì)胞≥80%左右貼壁或（繼而）較多局部細(xì)胞群落密集時(shí)，即可開(kāi)始傳代。 ⑵優(yōu)化分離技術(shù)：將獲取的臍帶去除血污并進(jìn)行消毒，使用眼科剪將臍帶對(duì)半剪開(kāi)，除去動(dòng)靜脈,使用無(wú)菌刀柄將膠狀物從臍帶內(nèi)壁上刮下來(lái)，將膠狀物剪碎1mm×1mm 大小，接種密度以300～350 小塊為宜。 將其置于培養(yǎng)箱中靜置30min后加入2ml 的原代培養(yǎng)液，放置于37℃，5%濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)處理， 并于24h 后再次加入10ml 的培養(yǎng)液。 之后定期6d 進(jìn)行1 次全量換液,培養(yǎng)9d 左右若見(jiàn)組織泥漂浮于培養(yǎng)液中，去除大量的漂浮組織并予以換液，待細(xì)胞≥80%左右貼壁或（繼而）較多局部細(xì)胞群落密集時(shí)，即可開(kāi)始傳代。 ⑶細(xì)胞體外培養(yǎng)傳代：每天于顯微鏡下對(duì)不同分離方式獲取的細(xì)胞生長(zhǎng)情況予以觀察，并記錄獲取原代細(xì)胞生長(zhǎng)所用時(shí)間,即初次見(jiàn)貼壁細(xì)胞以及80%貼壁/可傳代時(shí)間。⑷細(xì)胞計(jì)數(shù)：采集細(xì)胞懸液,500g 離心5min 處理，隨后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板完成細(xì)胞計(jì)數(shù)。 即待細(xì)胞懸液靜置30min 后，在顯微鏡下觀察,并計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)板4 個(gè)大方格內(nèi)所具有的細(xì)胞數(shù)。 細(xì)胞得率計(jì)算公式為80%踢被細(xì)胞懸液總數(shù)與分離長(zhǎng)度的比值。 ⑸細(xì)胞增殖情況檢測(cè)：分別取不同方式獲得的細(xì)胞，獲取第3 代、6代、9 代細(xì)胞。 以單細(xì)胞懸液為目標(biāo)對(duì)其進(jìn)行制備,并接種于24 孔板, 加入DMEM+10%FBS 培養(yǎng)液，放置在37℃，5%濃度二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 定期3d 換液1 次，分別取3 孔不同代細(xì)胞的計(jì)數(shù)，取平均值。 ⑹檢測(cè)方式：對(duì)照組采用傳統(tǒng)細(xì)胞檢測(cè)方式； 研究組則采用質(zhì)譜儀完成細(xì)菌感染性方面的檢測(cè), 以熒光PCR 技術(shù)完成和支原體感染方面的檢測(cè)。 其中成骨分化茜素紅染色、成脂肪分化油紅“O”染色以及成軟骨分化切片染色，見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 成骨分化茜素紅染色

圖2 成脂肪分化油紅“O”染色圖

圖3 成軟骨分化切片染色

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及得率情況，第3 代、6 代、9 代細(xì)胞的增殖情況，細(xì)胞檢測(cè)時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析主要通過(guò)SPSS21.0 軟件進(jìn)行處理，且以[n(%)]對(duì)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)實(shí)施表示，予以2 檢驗(yàn)。以（±s）對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)實(shí)施表示，予以t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及得率情況對(duì)比 研究組初次見(jiàn)貼壁細(xì)胞時(shí)間、80%貼壁/可傳代時(shí)間相比對(duì)照組較低，而細(xì)胞得率相比對(duì)照組較高（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及得率情況對(duì)比（x±s）

2.2 兩組第3 代、6 代、9 代細(xì)胞的增殖情況對(duì)比研究組第3 代、6 代、9 代細(xì)胞4d、8d 時(shí)的細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表2、圖4。

圖4 處于增殖期的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

2.3 兩組細(xì)胞檢測(cè)時(shí)間對(duì)比 研究組細(xì)胞檢測(cè)時(shí)間為（0.81±0.15），相比對(duì)照組的（2.34±0.21）d 較低，差異明顯（t=18.748，P=0.000）。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞的治療技術(shù)目前已得到國(guó)內(nèi)外廣泛研究學(xué)者的關(guān)注,為部分疑難雜癥的治療帶來(lái)了希望[7-9]。 然而，干細(xì)胞治療的安全性、有效性不但和干細(xì)胞制劑的本身有關(guān),同時(shí)與干細(xì)胞制備環(huán)節(jié)密切相關(guān),間充質(zhì)干細(xì)胞的制備是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且不受污染影響，直接決定了其在臨床中的可行性、安全性[10-12]。 既往，臨床上應(yīng)用較為廣泛的分離人UCMSC 的手段囊括組織塊法、 酶解組織法、聯(lián)合酶消化法等[13-16]。 不同的分離手段存在不同的優(yōu)點(diǎn)和不足之處：其中組織塊法具有操作簡(jiǎn)單、不會(huì)損傷細(xì)胞以及細(xì)胞活性較佳等優(yōu)勢(shì),然而該技術(shù)的培養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)，且獲得率不理想，無(wú)法迅速獲取人UCMSC。酶解組織法存在消化時(shí)間較長(zhǎng)，傳代后細(xì)胞的貼壁率較低等缺陷[17,18]。 而聯(lián)合酶消化法消化時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，且由于消化時(shí)間的掌握難度較高，從而極易導(dǎo)致細(xì)胞粘附性下降，進(jìn)一步引起貼壁率較低，最終導(dǎo)致試驗(yàn)失敗[19,20]。 目前，臨床上針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法為細(xì)胞回輸?shù)漠?dāng)天獲取結(jié)果，因此無(wú)法為細(xì)胞的回輸提供安全保障。 而隨著近年來(lái)醫(yī)療水平的不斷發(fā)展, 質(zhì)譜技術(shù)以及熒光PCR 技術(shù)開(kāi)始被應(yīng)用于臨床中,可能成為間充質(zhì)干細(xì)胞和質(zhì)量檢測(cè)的有效手段，具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值。

表2 兩組第3 代、6 代、9 代細(xì)胞的增殖情況對(duì)比（例，x±s）

本研究結(jié)果表明, 研究組初次見(jiàn)貼壁細(xì)胞時(shí)間、80%貼壁/可傳代時(shí)間相比對(duì)照組較低，而細(xì)胞得率相比對(duì)照組較高，與此同時(shí)，研究組第3 代、6代、9 代細(xì)胞4d、8d 時(shí)的細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，這表明了優(yōu)化法應(yīng)用于人UCMSC 的獲取中具有高效、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，且操作簡(jiǎn)單、可控性強(qiáng)，值得臨床推廣應(yīng)用。 究其原因，本研究所采用的優(yōu)化法主要是利用了人UCMSC 的趨化性特點(diǎn)，促使其自發(fā)聚集于創(chuàng)口部位，繼而爬出組織且開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。 同時(shí)， 該法有利于細(xì)胞維持原有的活性以及生長(zhǎng)趨勢(shì)，且在分離過(guò)程中會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，因此在換液傳代后可獲得更為明顯的細(xì)胞增殖能力。 此外，該法所獲取的臍帶組織更為細(xì)小,從而使得其貼壁牢固性更佳，繼而可縮短爬出細(xì)胞的時(shí)間，進(jìn)一步縮短可傳代用時(shí)。 筆者體會(huì)：優(yōu)化法主要是利用物理方式自臍帶膠狀組織內(nèi)提取UCMSC, 且相比傳統(tǒng)貼壁法帶臍帶內(nèi)皮組織一起剪碎等一步驟，在一定程度上縮短了操作時(shí)間。 其在刮下來(lái)的膠狀組織，更有利于貼壁，并在加液后不會(huì)輕易漂浮，細(xì)胞更易爬出，獲得到的細(xì)胞更純。 加之換液的次數(shù)相對(duì)較少，可有效節(jié)省人力物力。 另外，研究組細(xì)胞檢測(cè)時(shí)間相比對(duì)照組較低,這提示了快速檢測(cè)體系的建立有利于縮短人UCMSC 的檢測(cè)時(shí)間，避免了醫(yī)療資源的浪費(fèi)，減輕了醫(yī)務(wù)人員的工作量。究其原因,筆者認(rèn)為質(zhì)譜儀主要是利用高能電子流等對(duì)樣品分子予以“轟擊”，從而促使該分子喪失電子轉(zhuǎn)變成待正電荷的分子離子以及碎片離子，而上述差異性離子的質(zhì)量不同,與磁場(chǎng)的作用下到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間亦存在差異，繼而形成質(zhì)譜圖，為臨床檢測(cè)提供可快速、可靠的數(shù)據(jù)。熒光PCR 主要是指于PCR 反應(yīng)體系內(nèi)加入熒光基團(tuán), 從而利用熒光信號(hào)對(duì)整個(gè)PCR 過(guò)程予以監(jiān)測(cè), 隨后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線完成未知模板定量分析的一種手段,目前已被廣泛應(yīng)用于臨床中，效果明顯[21]。

綜上所述，優(yōu)化法可高效、低成本地獲取高質(zhì)量人UCMSC, 且與操作方面完全可建立一套規(guī)范的標(biāo)注你操作規(guī)程以及質(zhì)量控制流程。 同時(shí)，快速檢測(cè)體系的建立可顯著縮短人UCMSC 的檢測(cè)時(shí)間，有利于避免醫(yī)療資源的過(guò)度浪費(fèi)，值得臨床推廣應(yīng)用。