小鼠過敏性哮喘模型肺組織中Th9 細(xì)胞相關(guān)因子的變化及意義

付宗強，牛小斌，張匯征，李永偉

（1.河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州450002；2.重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心中心實驗室，重慶 重慶400036）

過敏性哮喘是哮喘的主要類型,它以慢性氣道炎癥為特征，多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與，包括T 淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，及這些細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子所形成的復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[1,2]。目前研究認(rèn)為Th2 細(xì)胞及其細(xì)胞因子譜可以調(diào)節(jié)過敏性氣道炎癥，導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性，Th1/Th2細(xì)胞失衡對于氣道重構(gòu)有促進(jìn)作用[3]。 最近研究表明IL-9 在過敏性哮喘的進(jìn)展過程中也起到重要的調(diào)節(jié)作用，IL-9 起初被認(rèn)為是Th2 類細(xì)胞因子，它可以由IL-2、IL-4 和TGF-β 誘導(dǎo)產(chǎn)生，而被IFNγ 抑制[4]，但是研究發(fā)現(xiàn)IL-9 主要來自于一個新的細(xì)胞亞群，這個新的CD4+細(xì)胞亞群并不表達(dá)現(xiàn)有Th 細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子[5,6]，因此被稱為Th9 細(xì)胞。本研究建立了小鼠哮喘模型, 檢測小鼠肺組織中Th9 細(xì)胞相關(guān)因子的變化，進(jìn)一步探討Th9 細(xì)胞及其細(xì)胞因子在過敏性哮喘中的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠過敏性哮喘模型的建立 SPF 級雌性BALB/c 小鼠24 只（購自河南省實驗動物中心），6~8w 齡，體重18~22g，用隨機(jī)數(shù)字表將其分為對照組和哮喘模型組， 每組12 只。 模型組小鼠在第1天和第14 天腹腔注射0.2ml 卵白蛋白溶液（OVA，Grade Ⅴ,Sigma A5503）進(jìn)行致敏，在第28~30 天將小鼠置于自制的5L 容器中超聲霧化吸入1%濃度的OVA 進(jìn)行激發(fā)，每天激發(fā)一次，每次20min，對照組則用同等體積的生理鹽水代替處理。0.2mlOVA 致敏液含20μg OVA 和0.1ml 液態(tài)鋁佐劑（Imject Alum，Thermo Pierce）。

1.2 小鼠氣道反應(yīng)性檢測 末次激發(fā)24h （第31天）后，應(yīng)用全身體積描記儀無創(chuàng)肺功能檢測系統(tǒng)（Whole-body Plethysmograph, WBP，Buxco 公司）檢測小鼠氣道增強的呼吸間歇 （enhanced pause,Penh）。 將兩組小鼠分別用生理鹽水和梯度濃度的乙酰甲膽堿（Mch，Sigma A2251）進(jìn)行激發(fā)后，轉(zhuǎn)入WBP 中記錄Penh 值, 并計算Penh%值 （Penh%=Mch 激發(fā)后的Penh/生理鹽水激發(fā)后的Penh×100%），來反映小鼠氣道阻力的變化程度。 所用的Mch 梯 度 濃 度 依 次 為6.25mg/ml、12.50 mg/ml、25.00 mg/ml 和50.00mg/ml。

1.3 小鼠標(biāo)本的獲取及處理 第32 天。

1.3.1 肺組織 摘取小鼠肺臟， 左側(cè)肺葉用福爾馬林固定，行HE 染色（n=6）；右側(cè)肺葉放入液氮中，提取RNA， 逆轉(zhuǎn)錄，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測IL-9、IL-9R 和轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA 表達(dá)水平（RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 試劑盒均購自TaKaRa 公司）。 每個標(biāo)本設(shè)3 個副孔，各引物來自Primer Bank，引物序列見表1，由上海生工生物有限公司合成。 各步操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

表1 各指標(biāo)引物序列及擴(kuò)增片段長度

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液 （bronchoalveolar lavage fluid, BALF） 對小鼠進(jìn)行氣管插管, 用冷PBS（4℃）進(jìn)行支氣管肺泡灌洗3 次，0.8ml/次，收集灌洗液，回收率≥80%，3000r/min 離心5min， ELISA 法檢測上清中各細(xì)胞因子(IL-4、INF-γ、IL-9 和OVA特異IgE，R&D 公司)的含量。各步操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計分析 應(yīng)用spss18.0 及GraphPad 7.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和生成圖表;所得數(shù)據(jù)以x±s 表示,數(shù)據(jù)正態(tài)分布和方差齊的, 兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，否則進(jìn)行秩和檢驗；各因子間的相關(guān)系采用Pearson 線性相關(guān)分析；顯著性檢驗水準(zhǔn)為P＜0.05。SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計算mRNA 的相對表達(dá)量,相對表達(dá)量升高2 倍或降低0.5 倍，認(rèn)為有意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠激發(fā)時的表現(xiàn) 哮喘模型組小鼠受OVA或Mch 激發(fā)時，起初表現(xiàn)為躁動不安，前爪搔鼻、呼吸急促，腹式呼吸、弓背呼吸，隨后站立不動出現(xiàn)喘息癥狀；對照組小鼠受則沒有這些表現(xiàn)，只是受到驚擾后的活動增加，偶有搔鼻，打噴嚏。

2.2 肺組織HE 染色 模型組小鼠支氣管壁和肺泡壁明顯增生，形態(tài)發(fā)生變化，更為狹窄不規(guī)則，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤、充血水腫表現(xiàn)；而對照組小鼠的支氣管和肺泡形態(tài)較規(guī)則， 無明顯增生和細(xì)胞浸潤表現(xiàn)。 見圖1。

圖1 小鼠肺組織HE 染色圖片（×200）

2.3 Mch 激發(fā)后小鼠Penh 檢測 對照組n=12，模型組n=12。 兩組小鼠的Penh%隨Mch 劑量的增加都有升高的趨勢, 但是模型組小鼠上升的更快，特別是在受到25.00mg/ml 和50.00mg/ml Mch 激發(fā)后，兩組的Penh%具有顯著性差異。 見圖2。

圖2 兩組小鼠受梯度劑量Mch 激發(fā)后Penh%的變化

2.4 BALF 上清中各細(xì)胞因子及OVA 特異IgE 含量 與對照組相比，過敏性哮喘小鼠BALF 上清液中Th2 類細(xì)胞因子IL-4、IL-9 水平顯著升高，而Th1 類細(xì)胞因子INF-γ 則顯著下降；另外對于OVA 特異的抗體IgE 的含量也是顯著升高的。 對照組n=6，模型組n=6。

圖3 小鼠BALF 中各細(xì)胞因子及OVA 特異IgE 的水平

2.5 模型組小鼠肺組織中Th9 相關(guān)分子mRNA 的相對表達(dá)量 采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 檢測了兩組小鼠肺組織中Th9 相關(guān)分子mRNA 的相對表達(dá)水平,結(jié)果顯示，在模型組小鼠肺組織中IL-9、IL-9R 及Th9 細(xì)胞的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA 表達(dá)水平與對照組相比均顯著增高，增高的倍數(shù)分別為2.64~4.42 倍、5.32~9.36 倍、4.89~8.67倍。 對照組n=6，模型組n=6。

圖4 模型組小鼠肺組織中IL-9、IL-9R 及PU.1 mRNA 相對表達(dá)水平

2.6 小鼠肺組織中各個因子間的相關(guān)性分析 小鼠肺組織中PU.1 mRNA 的相對表達(dá)量與IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 的相對表達(dá)量呈顯著的正相關(guān)系（r=0.759，P=0.004；r=0.856，P=0.000），并且與小鼠BALF 上清液中的IL-9 及OVA 特異IgE 含量也有明顯的正相關(guān)系（r=0.882，P=0.000；r=0.848,P=0.000）,見圖5a、b、c、d；小鼠BALF 中OVA 特異IgE 的含量與IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 相對表達(dá)量及BALF 中的IL-9 含量呈顯著的正相關(guān)系 （r=0.807,P=0.002；r=0.851,P=0.000；r=0.918,P=0.000）,見 圖5e、f、g； 小 鼠BALF 中IL-9 含 量 與 傳 統(tǒng) 的Th2 類細(xì)胞因子IL-4 的含量呈正相關(guān)關(guān)系 （r=0.912，P=0.000）,而與傳統(tǒng)的Th1 類細(xì)胞因子INFγ 有明顯的負(fù)相關(guān)系（r=-0.799，P=0.002）,見圖5h、i。

3 討論

過敏性支氣管哮喘是一種常見的慢性炎癥性疾病，兒童的發(fā)病率高于成人，并具有遺傳傾向，過敏性哮喘患者及其家人往往也患有其他過敏性疾病，如濕疹、過敏性鼻炎等[2,7]，患者體內(nèi)IgE 水平升高,肺部有嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤，并有Th 細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子譜的紊亂[8,9]。 大量的研究表明，過敏性哮喘患者體內(nèi)存在Th1 細(xì)胞與Th2細(xì)胞的比例失衡，Th2 細(xì)胞過度分化及其相關(guān)的Th2 類細(xì)胞因子參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)患者肺部高濃度的IL-4 可以誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換（產(chǎn)生大量的IgE）[7]，另一種Th2類細(xì)胞因子IL-5 可以誘導(dǎo)和募集嗜酸性粒細(xì)胞在肺部聚集，Th2 細(xì)胞及細(xì)胞因子也參與了肺部組織細(xì)胞的重構(gòu)[2,10]，然而傳統(tǒng)的Th1/Th2 比例失衡理論并不能完全解釋過敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制。

圖5 小鼠肺組織中Th9 相關(guān)因子與其他分子間的相關(guān)性分析

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IL-9 可能在過敏性哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用，IL-9 常常與Th2類細(xì)胞因子相伴升高,人們往往將其歸為Th2 類細(xì)胞因子[11]。然而Veldhoen[6]等人研究發(fā)現(xiàn)TGF-β 可以使IL-4、IL-5、IL-13 和轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 表達(dá)缺失，轉(zhuǎn)而產(chǎn)生大量的IL-9，將其歸為Th2 類細(xì)胞因子并不妥當(dāng)。與此同時，Dardalhon[5,12]的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)IL-4 與TGF-β 共存時可誘導(dǎo)IL-9+IL-10+Foxp3-的T 細(xì)胞產(chǎn)生,這一細(xì)胞亞群不同于傳統(tǒng)的Th 細(xì)胞亞群，它以分泌IL-9 為主要特點，并不表達(dá)傳統(tǒng)Th 細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子，因此將其定義為Th9 細(xì)胞。 與TH9 細(xì)胞相關(guān)的因子眾多，主要包括轉(zhuǎn)錄因子PU.1、IRF1、IRF4 等，TH9 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-9、IL-10,與其分化密切相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β、IL-4，IL-6、IL-21、IFN-γ 等, 以及TH9 細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的相關(guān)受體, 目前研究表明TH9 的細(xì)胞表型與PU.1 的關(guān)系密切，它為TH9 特異的轉(zhuǎn)錄因子, 另外與小鼠TH9 細(xì)胞不同的是人類的TH9 細(xì)胞分泌IL-9 并不分泌IL-10[1,16,18]。 本研究復(fù)制了小鼠哮喘模型，并通過WBP 系統(tǒng)驗證了哮喘模型小鼠氣道的高反應(yīng)性,以及哮喘患者呼氣時相延長的特征,并對小鼠的肺組織進(jìn)行了病理染色,結(jié)果顯示模型組小鼠肺組織中有充血水腫表現(xiàn)，并有大量炎癥細(xì)胞浸潤，這與哮喘患者的肺組織病理表現(xiàn)一致。 本文以此為基礎(chǔ)來探討小鼠肺組織中Th9 細(xì)胞相關(guān)分子間相互關(guān)系。

有研究發(fā)現(xiàn)在過敏性哮喘患者肺組織中Th9數(shù)量與氣道反應(yīng)性呈正相關(guān)，IL-9 水平升高[13]； 有關(guān)動物實驗顯示，應(yīng)用抗體中和IL-9 后，小鼠氣道高反應(yīng)性得到下降，肺組織中細(xì)胞浸潤減少，氣道炎癥狀態(tài)得到改善[14],IL-9 可以促進(jìn)由Th2 類細(xì)胞因子IL-4 誘導(dǎo)的免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換,然而IL-9 對抗體的單獨作用并不清楚[15]。PU.1 是轉(zhuǎn)錄因子ETS（E26 transformation specific or E-twenty-six）家族成員，它可以和Th9 細(xì)胞的IL-9 基因啟動子直接結(jié)合，促進(jìn)分泌IL-9，并在Th9 細(xì)胞的分化和功能的維持方面起到重要的作用, 因此PU.1 被認(rèn)為是Th9 細(xì)胞關(guān)鍵性的必需的轉(zhuǎn)錄因子[16,17]。 但PU.1作為轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)確認(rèn)110 多個直接的靶基因，這其中不僅包括細(xì)胞因子、細(xì)胞增殖分化基因，還包括受體、抗體以及補體基因，PU.1 與Th1 類、Th2類細(xì)胞因子及IgE 的關(guān)系并不十分清楚[18-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織PU.1 mRNA 的相對表達(dá)量明顯高于對照組,并與IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 呈顯著的正相關(guān)關(guān)系, 同時與其呈明顯正相關(guān)的還有小鼠肺組織中的OVA 特異性IgE 抗體。 這些結(jié)果提示PU.1 可能在這些分子的表達(dá)過程中起到重要的作用。 本研究還檢測了小鼠BALF上清中IL-4、IL-9、INF-γ 及OVA 特異的抗體IgE的含量， 以及小鼠肺組織中IL-9 mRNA、IL-9R mRNA 的相對表達(dá)水平,研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比在小鼠哮喘模型肺組織中除INF-γ 水平顯著下降外,其他分子均明顯上升,小鼠哮喘模型肺組織中存在著IL-4/INF -γ 失衡,這與以往的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步的因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)IL-9 含量及其mRNA相對表達(dá)量與IL-4 及OVA 特異IgE 含量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，但與INF-γ 具有明顯的負(fù)相關(guān)系，這提示在小鼠哮喘模型肺組織中也存在著IL-9/INF-γ 紊亂,這些分子的改變可進(jìn)一步通過受體作用于細(xì)胞，可能在哮喘的發(fā)病、發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

Th9 細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)，及其相應(yīng)的細(xì)胞因子譜的研究，使我們對許多疾病有了新的認(rèn)識，它為Th細(xì)胞亞群的研究注入了新的活力,對于過敏性支氣管哮喘來說,本研究及以往的結(jié)果提示Th9 及其相關(guān)的因子在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要的調(diào)節(jié)作用,Th9 及相關(guān)分子也為過敏性哮喘的診斷和治療提供了潛在靶點。